八肽胆囊收缩素对缺氧缺血性细胞损伤模型的干预作用

目的：研究八肽胆囊收缩素(CCK-8)对缺氧缺血神经细胞凋亡的干预作用,以及凋亡过程中对神经生长因子(NGF)蛋白及NGF mRNA表达的影响。方法体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞7 d,作为空白对照组(A组),用50μmol/L谷氨酸浸泡处理后建立缺氧缺血细胞损伤模型(B组/模型组),将CCK-8分别以浓度1×10-6 mol/L (C组)、1×10-7 mol/L (D组)、1×10-8 mol/L (E组)进行干预,作用后继续培养细胞24 h,采用原位末端标记技术检测各组细胞凋亡率、免疫细胞化学检测NGF蛋白表达,原位杂交技术检测NGF mRNA表达。结果 A组细胞有少量凋亡,凋亡率为(8.49±4.54)%,C组和D组细胞凋亡率分别为(3.87±5.64)%、(7.84±4.19)%,较B组的(17.53±6.93)%明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),而E组凋亡率为(13.27±3.41)%,与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组未检测出NGF蛋白表达(OD值0),C组[OD值(0.3432±0.00681)]和D组[OD值(0.3012±0.00187)]较B组[OD值(0.2837±0.00769)] NGF蛋白表达明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05),E组[OD值(0.2752±0.00373)]与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组有少量NGF mRNA表达[OD值(0.2866±0.00441)],C组[OD值(0.3474±0.01004)]和D组[OD值(0.3294±0.01922)]较B组[OD值0.3012±0.00187)] NGF mRNA表达明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05),E组[OD值(0.2968±0.00378)]与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CCK-8能够抑制缺氧缺血细胞模型凋亡,减轻神经细胞损伤的程度,其神经保护机制与促进NGF蛋白及NGF mRNA表达增加有关。     

八肽胆囊收缩素对新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响

目的：探讨八肽胆囊收缩素（octa-peptide cholecystokinin,CCK8）对体外培养的新生小鼠大脑皮层神经元生长的影响。方法：原代培养新生小鼠大脑皮层神经元,采用烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）免疫细胞化学染色法鉴定皮层神经元,培养24h的皮层神经元随机分为对照组和CCK8刺激组（终浓度为10-7mol/L）,作用24h、48h、72h、96h后,倒置相差显微镜下行动态观察,MTT法检测细胞的生长活性并以OD值绘制生长曲线。结果：CCK8处理后,有突起的神经元数目增加,存活时间延长,同一时间点的细胞活性明显增强,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：CCK8能促进皮层神经元的生长,延长其存活时间。     

八肽胆囊收缩素对大鼠大脑皮质蛋白激酶CI知性的影响

目的：探讨胆囊收综素受体（CCK receptor)在中枢神经系统的信号传递机制。方法：采用分离的大鼠大脑皮质神经细胞，观察CCK8，CCKA受体拮抗剂L－364，718和CCKB受体拮抗剂L－365，260对大鼠大脑皮质蛋白激酶C（PKC）活性的影响，结果：CCK8在10^-11-10^-6mol/L范围内可刺激PKCI知性的增加，超过10^-6mol/L后，逐渐趋于饱和，CCKA受体拮抗剂L－364，718，CCKB受体拮抗剂L－365，260均可根据剂量的大小不同程度地抑制CCK8引起的PKC活性改变，但两者IC50相差60倍，L－365，260在较低浓度时即能明显拮抗CCK8引起的PKC活性变化。结论：本研究结果提示，CCK8可能通过CCKB受体引起PKC活性变化，而PKC可能是CCKB受体的重要信号传递机制之一。^     

游离脂肪酸对人胰岛β细胞凋亡的影响及氨基胍的保护作用

目的:初步探讨游离脂肪酸对人胰岛β细胞凋亡的影响及其分子机制.方法:体外分离培养人胰岛细胞,免疫组化鉴定β细胞后分为对照组、游离脂肪酸组和氨基胍组,37℃、5%CO2培养72 h后做胰岛素释放实验,测定培养液上清胰岛素和一氧化氮(NO)水平.原位末端核苷酸标记法(TUNEL)和胰岛素免疫组化双染色法及ELISA检测胰岛β细胞凋亡,RT-PCR检测胰岛细胞p53 mRNA和bcl-2 mRNA表达水平.结果:游离脂肪酸组胰岛β细胞凋亡小体富计因子(6.37±3.4)、β细胞凋亡百分数(16.9%)、NO(187.35±20.99)μmol/L和p53 mRNA表达水平(0.645±0.029)均显著高于氨基胍组[分别为(1.17±0.2)、6.2%、(130.8±9.2)μmol/L和(0.47±0.02),P＜0.05]和对照组[分别为(1.11±0.4)、4.8%、(103.3±31.2)μmol/L和(0.35±0.03),P＜0.01],而胰岛素(9.27±1.13)mU·L-1·1×106cells和bcl-2 mRNA(0.131±0.046)表达水平则显著低于氨基胍组和对照组(P＜0.05).结论:游离脂肪酸可诱导人胰岛β细胞凋亡,其机制可能与胰岛β细胞抗氧化能力降低引起p53表达增加和bcl-2表达降低有关,氨基胍可部分防止游离脂肪酸诱导的人胰岛β细胞凋亡.     

不同糖耐量者血清游离脂肪酸与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能的关系

比较不同糖耐量者空腹、糖负荷后30min及120min血清游离脂肪酸水平、各时间点游离脂肪酸与胰岛素抵抗以及胰岛β细胞功能的相关性。结果显示3组间空腹及糖负荷后游离脂肪酸水平差异有统计学意义，空腹、糖负荷后30min及120min游离脂肪酸水平与胰岛素分泌功能以及胰岛素敏感性指数呈负相关。提示游离脂肪酸对胰岛β细胞功能和胰岛素敏感性存在负面、毒性作用。     

胰高血糖素样多肽1拮抗游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞胰腺衍生因子表达与机制

目的 观察游离脂肪酸(FFA)对胰岛β-TC3细胞胰腺衍生因子(PANDER)表达的影响,并探讨胰高血糖素样多肽1(GLP-1)对其的拮抗作用及与蛋白激酶B(Akt)信号通路的关系.方法 培养β-TC3细胞,以不同浓度棕榈酸(PA)处理12 h,0.5 mmol/L的PA处理不同时间后实时荧光定量PCR法检测PANDER mRNA表达;Western印迹检测对照组、PA组、PA+GLP-1组、GLP-1组处理12 h后PANDER、P-Akt及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3酶原蛋白表达;在上述各组加入Akt特异阻断剂(Akti-1/2)后,再检测PANDER蛋白表达,并以Hoechst33258核染色法检测细胞凋亡情况.结果 (1)PA浓度依赖性及时间依赖性增加PANDER mRNA表达(P<0.05);(2)与对照组(100%)比较,PA组诱导PANDER蛋白表达高[(148±18)%,P<0.05),PA+GLP-1组PA诱导PANDER表达为[(70±17)%,P<0.01];(3)Akti-1/2减弱GLP-1抑制PA诱导的PANDER表达及细胞凋亡的效应:PA+GLP-1+Akti-1/2组较PA+GLP-1组PANDER蛋白显著高[(249+49)%比(110±54)%,P<0.01],细胞凋亡率显著高[(37.8±-1.5)%比(20.1±3.5)%,P<0.01].结论 PA可诱导PANDER的表达及胰岛B细胞凋亡,GLP-1通过激活Akt通路拮抗PA诱导的PANDER表达及胰岛B细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the effects of free fatty acid(FFA)on the expression of pancreatic derived factor(PANDER)in β-cells and to explore the possible relationship between PANDER and Akt signaling pathway at the anti-apoptotic effects of glucagon-like peptide-l(GLP-1).Methods β-TC3 cells were cultured in vitro witH palmitic acid(PA)of different concentrations and different time courses.The expression of PANDER mRNA was analyzed by realtime quantitative PCR β-TC3 cells were cultured with vehicle.0.5 mmol/L PA.0.5 mmol/L PA+10 nmol/L GLP-1 and 10nmol/L GLP-1respectively with or without Akti-1/2, a selective inhibitor of Akt, for 12 hours.The protein levels of PANDER, P-Akt and pro-caspase3 were detected by Western blot And cell apoptosis was analyzed by Hoechst33258 staining.Results (1)PA could dose and time dependently increased the expression of PANDER mRNA in β cells(vs control, P<0.05);(2)PA increased the PANDER protein expression [(148±18)%vs control 100%.P<0.05].However,these effects were attenuated by GLP-1 [(70±17)%vs PA group,P<0.01];(3)Akt inhibitor-1/2 alleviated the effects of GLP-1 on PA inducing the expression of PANDER.The expression of PANDER increased significantly in PA+GLP-1+Akti-1/2 group [(249±49)%vs PA+GLP-1 group(110±54)%,P<0.01],and cell apoptosis increased significantly as well[(37.8±1.5)%vs PA+GLP-1 group(20.1±3.5)%,P<0.01].Conclusion PA induces the expression of PANDER and the apoptosis of β cell while GLP-1 counteracts the above effects through an activation of Akt signaling pathway.     

八肽胆囊收缩素对小鼠神经元蛋白质磷酸化的影响

目的:从蛋白质可逆磷酸化修饰的角度,对小鼠神经元在八肽胆囊收缩素(CCK8)刺激下的信号转导通路进行初步研究.方法:将培养的小鼠神经元分为对照组(加入无磷培养基)、实验组(加入CCK8)、拮抗剂组(分别加入CCKA受体拮抗剂L-364 718和(或)CCKB受体拮抗剂L-365 260).采用双向电泳法观察CCK8和受体拮抗剂作用下蛋白质磷酸化水平的改变.结果:CCK8作用不同时间后,神经元蛋白质磷酸化状态发生明显改变,涉及的信号转导相关磷酸化蛋白质包括多种蛋白激酶、胞内信号分子、激素受体、转录因子等;动力学分析结果显示,主要的信号转导相关蛋白的磷酸化时间动力学曲线多数呈峰型;应用CCK受体拮抗剂作用后的结果表明,在皮质神经元中同时存在CCK的2种类型受体,其中B型受体介导的信号转导途径更复杂.结论:CCK A型、B型受体均可介导CCK8在神经元的信号转导,其中B型受体介导的信号途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径和JNK途径等.     

八肽胆囊收缩素对内毒素致离体兔肺动脉舒缩反应的影响

胆囊收缩素（Ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ，ＣＣＫ）是１９７６年确认的小分子脑－肠肽，ＣＣＫ８（ＣＣＫ２６３３）为内源性ＣＣＫ的重要功能片段。以往的研究多偏重于其在消化系统及神经系统的生物作用。ＣＣＫ具有调节胃肠运动及胆囊收缩、保护胃粘膜、抗阿片...     

八肽胆囊收缩素对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察八肽胆囊收缩（CCK－8）对大鼠肺缺血再灌注损伤（LIRI）的保护作用及其可能机制。方法建立大鼠在体肺缺血再灌注模型。将雄性Wistar大鼠30只随机分为手术对照组（C组）、缺血再灌注组（IR组）、CCK-8（K组）。每组45min再灌注120min时点处死10只大鼠,留取血浆和右肺组织,测定肺组织湿干质量比值（W／D）,髓过氧化物酶（MPO）活性,血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量,并进行肺组织病理学检查;结果再灌注期间IR组肺组织W／D、MPO活性、血清MDA均升高,而血清超氧化物歧化酶（SOD）降低。而预先给予CCK-8干预后可以减弱缺血再灌注诱导上述指标的变化。肺组织病理学检查显示CCK-8预先给药减轻肺缺血再灌注损伤。结论CCK-8对肺缺血再灌注损伤有保护作用．可能与其抑制氧自由基生成及中性粒细胞浸润有关。     

八肽胆囊收缩素对大鼠大脑皮质蛋白激酶C活性的影响

目的　探讨胆囊收缩素受体 (CCK receptor)在中枢神经系统的信号传递机制。方法　采用分离的大鼠大脑皮质神经细胞 ,观察 CCK8、CCKA 受体拮抗剂 L- 36 4,718和 CCKB受体拮抗剂 L- 36 5 ,2 6 0对大鼠大脑皮质蛋白激酶 C(PKC)活性的影响。结果　 CCK8在 10 - 1 1 ～ 10 - 6 mol/L范围内可刺激 PKC活性的增加 ,超过 10 - 6mol/L后 ,逐渐趋于饱和。 CCKA受体拮抗剂 L - 36 4,718、CCKB受体拮抗剂 L - 36 5 ,2 6 0均可根据剂量的大小不同程度地抑制 CCK8引起的 PKC活性改变 ,但两者 IC50 相差 6 0倍 ,L - 36 5 ,2 6 0在较低浓度时即能明显拮抗 CCK8引起的 PKC活性变化。结论　本研究结果提示 ,CCK8可能通过 CCKB受体引起 PKC活性变化 ,而 PKC可能是 CCKB受体的重要信号传递机制之一     

游离脂肪酸对猴胰岛微血管内皮细胞脂毒性的影响

目的观察游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)对恒河猴胰岛微血管内皮细胞(islet microvascular endo-thelial cells,IMECs)增殖和凋亡的影响及FFA介导的恒河猴IMECs氧化应激损伤。方法分离纯化恒河猴IMECs,分别用含有FFA(FFA组)和不含有FFA(对照组)的DMEM培养,MTT实验测定细胞增殖率(成活率),流式细胞仪检测细胞凋亡率,活性氧簇(ROS)酶联免疫分析(ELISA)测定IMECs中ROS的浓度。结果经24 h培养后,FFA组IMECs增殖率较对照组显著降低(P<0.01);Annexin V-FITC/PI双染色后FFA组于荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞;与对照组凋亡率比较,1.0 mmol/L FFA作用适当时间可显著升高IMECs凋亡率(P<0.01);FFA组IMECs中ROS水平较对照组显著升高(P<0.01)。结论高水平FFA可显著降低恒河猴IMECs增殖率,促进细胞发生凋亡,其凋亡可能与FFA介导的氧化应激损伤有关。     

谷氨酸铬对四氧嘧啶性糖尿病小鼠胰岛及B细胞形态结构的影响

[目的]探讨谷氨酸铬对糖尿病小鼠胰岛及B细胞的影响.[方法]用四氧嘧啶制作糖尿病小鼠模型,随机分为糖尿病对照组、实验Ⅰ组(每日灌胃给予谷氨酸铬250μg/kg)及实验Ⅱ组(每日灌胃给予谷氨酸铬125μg/kg),另设正常对照组.实验周期为3周,利用免疫组织化学方法观察胰岛及B细胞的组织学变化.[结果]实验Ⅰ组小鼠胰岛内空虚部分明显缩小,B细胞及其颗粒增多,界限较清楚.[结论]谷氨酸铬对四氧嘧啶所致小鼠胰岛及B细胞的损伤具有明显的改善作用.     

葡萄糖、游离脂肪酸对培养的人血管内皮细胞一氧化氮含量的影响

目的：观察不同浓度的葡萄糖(Glu)、软脂酸（PA）和油酸（OA）对培养24小时的人血管内皮细胞一氧化氮（NO）生成的影响。方法：采用硝酸还原酶法。结果：Glu（30mmol/L)组和Glu30mmol/L PA0.25mmol/L组细胞上清液中NO含量明显高于对照组（P＜0．05）；OA（0．025、0．5mmol/L）组，PA＋OA（PA0．25mmol/L＋OA0．5mmol/L）组及Glu＋PA＋OA（Glu30mmol/L＋PA0．25mmol/L＋OA0.5mmol/L）组细胞上清液中NO含量明显低于对照组（P＜0．05）；PA（0．125、0．25、0．5mmol/L）组与对照组，上清液中NO含量坎明显差异（P＞0．05）。结论：高浓度Glu作用于内皮细胞24小时使用内皮细胞生成NO增多，而OA抑制内皮细胞生成NO。高浓度OA与高浓度Glu联合作用时，OA抵消了Glu的作用，仍然使NO降低。高浓度Glu和游离脂肪酸对内皮细胞NO生成出现的相反效应的机制应进一步研究。     

供体凋亡细胞输注对大鼠胰岛移植物功能的影响

目的 研究供体凋亡细胞预输注对大鼠胰岛移植后胰岛移植物功能的影响.方法 应用STZ制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.经阴茎背静脉输注供体凋亡脾细胞,7d后于糖尿病SD大鼠双侧肾包囊进行同种异体胰岛移植,通过测定血糖变化、血清胰岛素水平以及胰岛移植物存活时间来观察胰岛移植物的功能状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位生存时间达31 d),并较长时间地维持受体鼠血清胰岛素处于较高水平.结论供体凋亡细胞预输注能够显著延长同种异体胰岛移植物的存活时间,能够较长时间维持胰岛移植物的正常功能状态.     

津力达颗粒对糖尿病大鼠胰岛B细胞的保护作用

目的 探讨津力达颗粒对糖尿病大鼠胰岛B细胞的保护作用。方法 将100只SPF级雄性SD大鼠除对照组外采用高脂饮食,链脲佐菌素腹腔一次性注射诱发糖尿病大鼠模型后随机分为模型组、（低中高剂量）津力达药物组、a-硫辛酸组、胰岛素组、二甲双胍组。各组给予灌胃给药（胰岛素组腹腔注射）。给药2个月后测定体重、空腹血糖（FBG）、胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（HbA1c）、氧化应激及炎症反应指标,并取胰尾组织行胰岛素免疫组化染色观察。结果 与模型组相比,其他各组FBG、HbA1c等均降低;津力达高剂量组SOD、GSH活性明显升高（P<0.01）,IL-1β、MDA含量降低（P<0.01）,胰岛B细胞免疫阳性染色的面积增加（P<0.01）,与糖尿病模型组比较差异有显著意义。结论 津力达颗粒对受损的糖尿病大鼠胰岛B细胞具有保护作用。     

颗粒细胞氧化应激及凋亡对IVF-ET结局的影响

目的：研究颗粒细胞丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平及凋亡对IVF-ET结局的影响。方法：选取51名首次行IVF-ET的输卵管性因素不孕患者。用GnRH-a长方案超促排卵治疗,密度梯度离心法分离卵泡液中颗粒细胞,硫代巴比妥酸法测定MDA水平,化学发光法测定SOD水平,流式细胞仪法测定凋亡率。结果：妊娠组与未妊娠组相比有较低的MDA水平和凋亡率,较高的优胚率,差异有统计学意义（P<0.05）。MDA与受精率呈中度负相关（r=-0.425,P=0.002）,与获卵数、成熟卵子数、卵裂率、优胚率无明显相关关系;SOD与之均无相关关系;凋亡率与获卵数(r=-286,P=0.042)、成熟卵子数(r=-0.330,P=0.020)、优胚率(r=-0.311,P=0.026)呈低度负相关。MDA与SOD呈中度负相关(r=-0.471,P<0.001);与凋亡率呈中度正相关(r=0.475,P<0.001)。结论：氧化应激可能导致卵巢颗粒细胞凋亡,进而影响卵子的发育潜能及IVF-ET的结局。     

探讨游离脂肪酸对近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制

目的探讨游离脂肪酸（Free Fatty Acids,FFAs）对人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）的影响及作用机制。方法用含有不同浓度（0、125、250、500μmol/L）软脂酸的DMEM-F12培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）,在0h、24h、48h三个时段：MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡和细胞周期的影响,免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中白细胞介素-β（IL-β）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果 FFAs呈剂量和时间依赖性抑制HK-2细胞的增殖（P〈0.05）,并可能通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡（P〈0.05）。经FFAs作用后,IL-β、IL-8的表达增加。结论游离脂肪酸有抑制HK-2细胞增殖,促进其凋亡的作用,同时炎性细胞因子IL-β、IL-8表达增多,参与了其发生和发展的过程。     

维生素B12对氧化应激损伤下神经细胞的保护机制

目的：探索维生素B12预处理对H2O2诱导下的神经细胞损伤的保护作用及自噬和凋亡蛋白表达的影响。方法：将大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12）分为对照组（Control组）RPMI 1640培养、损伤组（H2O2组）RPMI 1640培养并加入200 μmol/L的H2O2刺激,维生素B12保护组（H2O2+VitB12组）RPMI 1640培养加入200 μmol/L维生素B12预处理和200 μmol/L的H2O2刺激。24 h后检测细胞的活性,Western blot和免疫荧光检测凋亡及自噬相关蛋白表达水平。结果：与Control组比较,H2O2组的细胞存活率、细胞DNA复制水平降低,Bcl-2和P62蛋白的表达量下降,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量明显上升,胞浆内LC3的激活数量上升（均P＜0.05)。与H2O2组比较,H2O2+VitB12组细胞存活率和细胞DNA复制水平上升,Bcl-2和P62蛋白的表达量上升,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量显著下降,胞浆内LC3的激活数量下降（均P＜0.05)。结论：维生素B12能通过调控自噬抑制氧化应激诱导下的细胞凋亡。     

肌肽对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响及机制

目的探讨肌肽(carnosine)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs)增殖的影响及作用机制。方法以RMCs为研究对象,分别采用MTT法和BrdU-ELISA法观察肌肽对高糖诱导的RMCs增殖的影响;乳酸脱氢酶(LDH)法检测肌肽对细胞的毒性作用;酶生化法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性等。结果肌肽可显著抑制高糖诱导的RMCs增殖,在5～30 mmol/L范围内呈一定的浓度依赖效应,且与其抗氧化作用密切相关。结论肌肽通过抗氧化作用抑制高糖诱导的RMCs增殖,且有浓度依赖趋势。