短发夹状RNA对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用

目的探讨短发夹状RNA对糖调节蛋白78(GRP78)在结直肠癌RKO细胞中表达抑制作用。方法以脂质体Lipofectamine2000介导GRP78短发卡状RNA(shRNA-GRP78)质粒表达载体转染RKO细胞,G418筛选得到稳定表达株,半定量RT-PCR和Westernblooting方法检测GRP78mRNA和蛋白水平变化。结果转染成功并筛选出稳定表达RKO细胞株。与对照组相比,shRNA-GRP78转染RKO细胞GRP78的mRNA及蛋白水平均显著下降(t=7.079、7.510,P<0.05)。结论 shRNA-GRP78能明显抑制RKO细胞GRP78mRNA及蛋白的表达,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。     

靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的 利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析.方法 设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体.转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制效果.结果 酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同.RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用.COX-2 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%.结论 成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达.     

Nogo-A短发夹样RNA真核表达载体的构建

目的:构建靶向Nogo-A基因的短发夹样RNA(shorthairpinRNA,shRNA)真核表达载体。方法:根据Genebank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列,设计并化学合成2条shRNA,退火后克隆到pGenesil-1质粒的U6启动子下游从而构建重组载体,行限制性内切酶酶切和基因测序进行鉴定。结果:序列分析结果表明,两个重组质粒的shRNA编码序列均成功插入到预定位置。结论:成功构建靶向Nogo-A的shRNA真核表达载体,为进一步研究Nogo-A蛋白的功能及轴突再生抑制的基因治疗提供了新的方法。     

膜联蛋白Ⅱ基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建针对膜联蛋白(annexin)Ⅱ的短发夹RNA(shRNA)的表达载体,观察其对目的基因表达的影响.方法:根据GenBank中annexinⅡ基因已知序列设计了2条序列,即annexinⅡshRNA1、annexinⅡshRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接人pGenesil1载体,转化扩增后进行序列测定.3种重组表达载体均转染HEK293细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别在基因和蛋白水平上检测各自annexinⅡ的表达,以未转染细胞作为空白对照.结果:3种重组表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-annexinⅡshRNA2和pGenesil1- negative shRNA)经限制性酶切及测序分析证明基因插入正确.转染HEK293细胞后,转染pGenesil1-annexinⅡshRNA2组细胞annexinⅡ基因和蛋白表达明显低于转染pGenesil1-annexinⅡshRNA1、pGenesil1-negative shRNA以及空转染细胞(P＜0.05),而后三者间没有明显差异.结论:成功构建了针对annexinⅡ的shRNA表达载体(pGenesil1-annexinⅡshRNA2),转染细胞后可抑制annexinⅡ基因表达.     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.     

携带CBP短发夹RNA基因腺病毒表达载体的构建

目的:构建编码4条大鼠CREB结合蛋白(rCBP)短发夹RNA(shRNA)的腺病毒,检测RNA干扰技术(RNAi)下调rCBP mRNA的能力.方法:根据RNAi原理,设计4条针对rCBP的shRNA序列.PCR技术和酶切连接技术构建重组穿梭质粒Pgenesil4-rCBP-EGFP;体外同源重组技术构建可同时编码4...     

LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.     

特异性下调GRP78基因表达对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默葡萄糖调节蛋白78（GRP78）基因对人卵巢癌细胞耐药性的影响,阐明GRP78基因沉默逆转肿瘤细胞耐药性的生物学机制。方法：构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3/DDP细胞;RT-PCR和Western blotting法检测GRP78基因的蛋白的表达;Western blotting法检测caspase-4和caspase-3蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：转染GRP78 siRNA重组质粒的SKOV3/DDP细胞GRP78基因和蛋白表达较转染空质粒组明显降低(P<0.05);加用顺铂后,转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组较未转染GRP78 siRNA重组质粒细胞组caspase-4和caspase-3表达明显增加(P<0.05),细胞凋亡率也明显增加(P<0.05)。结论：抑制GRP78基因表达能通过上调caspase-4和caspase-3表达及增加顺铂诱导的SKOV3/DDP细胞凋亡率,降低SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定

目的 制备抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子(short hairpin RNA,shRNA),并鉴定其功能.方法 针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)核壳蛋白(nucleoprotein,NP)和酸性RNA多聚酶(acidic RNA polymerase,PA)编码mRNA高度保守区序列设计并制备编码shRNA的双链DNA转录模板,分别将其插入pGenSil-1质粒,构建NP-shRNA和PA-shRNA表达载体,测序正确后,采以T7转录试剂盒制备NP-shRNA和PA-shRNA.将所制备的2种shRNAs分别或联合转入人气道上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),然后感染IAV A/PR8株,通过测定HBE细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)、培养上清液病毒滴度以及NP、PA mRNA与蛋白表达水平,评估所制备的shRNAs对IAV A/PR8在HBE细胞中复制的抑制效果.结果 编码shRNA的2种舣链DNA转录模板序列正确.通过体外转录技术制备的NPshRNA、PA-shRNA每100 μl含量分别为59.4、50.6 nmol,纯度均在2.0以上,浓度和纯度均高.与未转染shRNA的对照组比较,NP-shRNA、PA-shRNA、NP-shRNA+PA-shRNA转染组细胞内NP mRNA分别减少41.7%、44.1%和68.5%,PAmRNA分别减少43.4%、60.9%和73.7%,NP蛋白表达分别降低92.3%、84.0%和91.7%,CPE显著减轻,培养上清液病毒滴度显著下降.结论 成功构建了2种抗IAV短发夹RNA分子,所制备的NP-shRNA、PA-shRNA对IAV A/PR8株在HBE细胞中复制有显著的抑制效果.     

针对IER3IP1基因的shRNA真核表达

目的:构建特异性针对IER3IP1基因的shRNA(Short Hairpin RNA)的真核表达载体,观察对IER3IP1基因表达的沉默作用,筛选出抑制效果较好的干扰片段.方法:针对IER3IP1基因,设计合成2对特异性DNA片段以及1对无关序列的阴性对照DNA片断,将它们插入真核表达载体pGenesil-1中构建重组质粒,质粒转染L02正常肝脏细胞株后,以半定量RT-PCR法检测转染后24、48、72 h IER3IP1基因的抑制效果.结果:成功构建2个特异性针对IER3IP1的shRNA真核表达载体;所构建的载体中有1对能够特异性的降低L02细胞中IER3IP1的mRNA表达水平,且干扰效果显著,抑制率较高,与空载对照组比在转染后24、48、72 h抑制率分别为64%、79%、69%.结论:设计构建的真核表达载体可以特异性干扰IER3IP1基因的表达,为进一步研究IER3IP1基因的功能奠定了基础.     

针对乙酰肝素酶基因的短发夹RNA干扰载体的构建

目的 构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹RNA(ahRNA)表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒...     

乙酰肝素酶基因靶向特异性RNA干扰重组表达载体的构建及筛选

目的 构建对人乙酰肝素酶(HPA)基因有特异性抑制作用的短发夹状RNA表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的人HPA基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染人MDA-MB-231细胞,分别以荧光定量PCR、Western blot分析其对HPA在mRNA水平和蛋白质水平上表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.在构建的5个载体中,HPSE-1组及HPSE-5组中MDA-MB-231细胞HPA基因mRNA和蛋白质表达水平明显下降,而对照组未发生明显改变.结论 成功构建了2个靶向人HPA的shRNA表达载体,转染MDA-MB-231细胞后可高效抑制HPA基因表达,为进一步研究HPA的表达与乳腺癌迁移和侵袭的机制奠定了基础.     

靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体.方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照.结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符.结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gs a 蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础.     

干扰转酮醇酶的短发卡RNA表达载体的构建与筛选

目的筛选出干扰小鼠转酮醇酶(TK)的短发卡RNA(shRNA)表达载体。方法针对TK基因序列设计4条TK干扰序列:hMGFP-shRNA1、hMGFP-shRNA2、hMGFP-shRNA3、hMGFP-shRNA4,PstⅠ酶切鉴定其序列。然后利用质粒转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,用逆转录-聚合酶链式反应和酶活性方法检测转染TKshRNA后Hepa1-6细胞内TK mRNA和蛋白表达变化。结果经酶切凝胶电泳证实shRNA载体构建正确,质粒筛选实验表明hMGFP-shRNA1质粒对TK基因的抑制作用最强。结论成功构建表达靶向TK的shRNA重组质粒载体。     

Smad4/DPC4基因小发夹RNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的：构建Smad4基因小发夹RNA（shRNA）表达载体。方法：设计、合成3对编码Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，并分别将其克隆人pGCsi—H1／Neo／GFP质粒，酶切、测序鉴定，脂质体法转染293细胞。实时荧光定量PCR检测RNA干扰（RNAi）的抑制效果。结果：在经Hindm和BamHⅠ双酶切分别鉴定三种重组载体后，DNA测序证实小干扰RNA（siRNA）序列正确，并被准确克隆人载体。实时荧光定量PCR检测结果表明三种重组载体psiSmad4—1、psiSmad4—2和psiSmad4—3载体，分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39．00％、8．80％和73．80％。结论：成功构建Smad4pGCsi—H1／Neo／GFP／shRNA质粒，为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础。     

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的：构建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照shRNA设计原则,合成对应的shRNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将shRNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。     

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shRNA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。     

小鼠P2X_7受体基因短发夹RNA慢病毒载体构建与鉴定

目的应用RNA干扰技术构建小鼠P2X_7受体(P2X_7R)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法对小鼠P2X_7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X_7R。筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定。测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清。经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X_7R shRNA慢病毒的干扰效率。结果测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X_7R及小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L~(-1),感染效率约为95%。干扰效率约为70%。结论应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。