重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

人血小板生成素cDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ，并研究其在ＣＯＳ－７细胞中的表达。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ法获得ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ，测序后克隆到真核表达载体ｐＥＤ上，以ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，巨核细胞集落形成培养法测表达产物活性。结果和结论：获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和献报道的序列一致。转染细胞ＲＮＡ斑点杂交结果显示ＴＰＯ ｃＤＮＡ获得转录，转染后４８和７２ｈ的细胞上清均可测到Ｔ     

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

建立Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡⅠ－１）ｃＤＮＡ哺乳动物细胞表达体系。用人工合成的６个寡核苷酸连接成编码ＰＡⅠ－１Ｎ－端１０个氨基酸和２３个氨基酸的信号肽顺序；将构成的完整ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＳＶ２ｄｈｆｒ中，获得真核表达质粒ｐＺＹＳ－１；将ｐＭＡ２１２中的ｈＭＴ－ⅡＡ的起动子再插入ｐＺＹＳ－１，使ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ受ＳＶ４０和ｈＭＴ－ⅡＡ双启动子控制，得ｐＺＹＳ－２。２个表达质粒分别在ＣＯＳ－７细胞中进行表达。结果：获得两个真核表达质粒，在ＣＯＳ－７细胞中得到表达，在培养液中的ＰＡⅠ－１活性和抗原含量分别为２３４．７ＩＵ／ｍｌ和３０μｇ／Ｌ。结论：ｐＺＹＳ－１和ｐＺＹＳ－２两株ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ真核表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中能有效表达和分泌。     

pCDM8-GFP报告载体的构建及鉴定

1　实验资料　ｐＤＭ 8 ＰＢＬｃＤＮＡ文库由Ｊａｃｋｓｏｎ博士惠赠 ,ｐＥＧＦＰ Ｎ3真核表达载体购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司 .ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄⅢ和Ｔ4ＤＮＡ连接酶购自大连宝生物公司 .ＣＯＳ7细胞为本室冻存。ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载体的构建方法参照文献 .提取 ｐＣＤＭ8 Ｘ(Ｘ表示载体中插入的未知ｃＤＮＡ片段 )和 ｐＥＧＦＰ Ｎ3质粒 ,分别用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切 ,回收酶切片段 ,用Ｔ4连接酶进行连接 ,转化感受态宿主菌。挑单菌落培养 ,提取质粒用ＮｏｔＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切进行阳性克隆鉴定 .提取重组ｐＣＤＭ8 ＧＦＰ载…     

重组人呷α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１－ｂＬＵＥ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后活为４．８×１０＾７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

重组人类促红细胞生成素治疗慢性肾功能衰竭贫血

应用重组人类促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）治疗１６例慢性肾功能衰竭（ＣＲＦ）维持血液透析（ＨＤ）患者的贫血，８周后，贫血明显改善，生活质量提高。共观察１２周。血红蛋白（Ｈｂ）由５１．４±９．３ｇ／Ｌ增至８８．４±４．７ｇ／Ｌ（Ｐ＜０．００１），红细胞比积（Ｈｃｔ）由１７．５±２．８％增至３１．７±４．２％（Ｐ＜０．００１）。     

人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

人骨保护素在COS7细胞内的瞬时表达

目的：在COS7细胞内初步表达人骨保护素（OPG）并观察其表达水平。方法：将OPG的重组表达载体pcDNA3．1／OPG—GFP^-转染COS7细胞进行瞬时表达,经RT—PCR和ELISA鉴定表达载体的功能及表达水平。结果：以人OPG全长编码序列构建的OPG表达载体pcDNA3．1／OPG-GFP^-,通过瞬时表达实验证实了该载体具有表达OPG的功能。结论：通过基因克隆技术可以成功构建有表达OPG功能的哺乳类表达载体,为后续的高效、稳定表达OPG奠定了基础。     

人白细胞介素10 cDNA重组质粒在细胞和大鼠体内的转染和表达

目的研究人白细胞介素10（hIL-10）cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg／mL,而对照组仅为55 pg／mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组（P〈0．05）,1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。     

Inhibitory Effects of Anti-sense PTTG on Malignant Phenotype of Human Ovarian Carcinoma Cell Line SK-OV-3

To construct eukaryotic expression vector expressing full length anti-sense pituitary tumor transforming gene (PTTG) mRNA and observe its blocking effect on the potential invasion of human ovarian carcinoma cell line SK-OV-3. PCR primers containing designed enzyme cut sites were used for cloning full-length PTTG gene fragment, and the resulting PCR product was inserted into the eukaryotic vector pcDNA3. 1 in the antisense direction. The recombinant vector was then transfected into SK-OV-3 by Lipofectamine. The positive cell clone was screened by G418, PTTG and bFGF at protein level expression were detected by Western blot. The biological behavior change of transfection positive cells was observed by colony formation in soft agar assay. Our results showed that SK-OV-3 clones stably expressing full-length recombinant pcDNA3. 1-PTTGas were obtained. The expressions of PTTG and bFGF protein in transfected cells were decreased by 61.5% and 52.3%, respectively as compared with non-transfected ones. The number of colony formation was reduced significantly in transfected cells as compared with empty vector transfected and non-transfected cells. It is concluded that the recombinant vector pcDNA3. 1-PTTGas is a novel tool and provides an alternative anti-sense gene therapy targeted at PTTG in human carcinoma.     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。