人野生型p53基因与逆转录病毒载体的构建及转染

应用逆转录病毒为载体构建了含人野生型ｐ５３基因的重组质粒，并成功地转染ψｃｒｉｐ包装细胞。本实验应用ＰＬＸＳＮ为载体，１．８ｋｂ野生型ｐ５３基因作为插入片段，通过Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶进行连接。用〔α—￣（３２）Ｐ〕ｄＣＴＰ标记野生型ｐ５３基因片段（１．８ｋｂ）为探针进行原位杂交。筛选出重组体，将其命名为ＰＬＸＳＮ－５３，然后用该重组体对ψｃｒｉｐ包装细胞进行转染。收集转染后的细胞，准备下一步感染ｐ５３突变细胞株研究之用。该质粒的构建和细胞转染实验为进一步研究野生型ｐ５３基因的抑癌作用及其表达与调控原理奠定了基础。     

P cDNA16-53融合表达载体的构建

目的：利用基因重组方法构建出含有抑癌基因 Ｐ１６, Ｐ５３的融合表达载体。方法：用限制性内切酶 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉ双酶切 Ｐ１６ Ａ,用 Ｎｈｅ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉ双酶切 Ｐ Ｍ Ａ Ｍ ｎｅｏ５３。采用低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法回收 Ｐ１６、 Ｐ５３基因片段,片段长度分别为８００ ｂｐ、１ ８００ ｂｐ。分别经抽提、沉淀、漂洗,使基因片段进一步纯化。利用定向克隆技术将 Ｐ１６、 Ｐ５３基因片段顺向插入经 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ、 Ｘｈｏ Ｉ双酶切后的ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,再次转化后经快速鉴定筛选出 ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ１６ ５３融合表达载体。结果： Ｐ１６、 Ｐ５３的融合表达载体大小８ ０００ ｂｐ、插入方向为正向。结论：用基因重组技术可以将两个抑癌基因构建在一个表达载体中进行表达,这为利用多基因治疗肿瘤的基础研究与临床研究提供了前提条件。     

重组P_(53)基因表达及其与Fas关系初探

为观察重组ＰｘＴ１－Ｐ５３在真核细胞中的表达及其与Ｆａｓ表达的关系，笔者采用磷酸钙—ＤＮＡ共沉淀法，ＤＥＡＥ—莆聚糖介导的ＤＮＡ转染法将ＰｘＴ１－Ｐ５３转移至ＰＡ３１７细胞内，并用抗Ｐ５３和抗Ｆａｓ抗体，经间接免疫荧光法证实转染ＰｘＴ１－Ｐ５３的ＰＡ３１７细胞不仅能表达Ｐ５３蛋白，而且亦能表达Ｆａｓ抗原。本实验结果表明笔者构建的ＰｘＴ１－Ｐ５３确实能在真核细胞内表达，并提示Ｐ５３可能通过其转录因子活性，诱导Ｆａｓ等基因表达，以阻止不能修复的已损伤ＤＮＡ的细胞发生恶性转化     

人野生型P53基因真核表达载体的构建及其转染胃癌细胞后对胃癌细胞的影响

人野生型Ｐ５３基因真核表达载体的构建及其转染胃癌细胞后对胃癌细胞的影响赵亚刚１，张学庸１，惠宏襄２，赵永同２，王成济２（１第四军医大学西京医院消化内科，西安７１００３３，２第四军医大学生物化学教研室）关键词Ｐ５３基因，逆转录病毒载体，基因治疗，流式细...     

携带野生型p53基因的重组腺病毒载体的构建

应用同源重组方法成功地构建了携带野生型Ｐ５３基因的复制缺陷型重组腺病毒，通过光镜电镜、酶切、ＰＣＲ共扩增等方法证实了构建载体的正确性，并使常规的同源重组方法进一步改进，简化了载体构建的操作程序，结果准确，成功率高。本结果可用于以腺病毒为载体进行肿瘤、心血管疾病等基因治疗的研究。     

质粒重组体构建中连接,转化时间的探讨

探讨质粒重组体构建中，重组体连接反应的时间对转化与基因克隆结果的影响。方法，Ｃ ＥＢＶＢＨＲ１基因与ＰＢＶ２２１载体的妆为研究对象，对连反应在３ｈ、６ｈ、１２、２４ｈ４个时段连接液的转化效果进行研究。     

卵巢癌的p53基因治疗实验研究：人野生型p53基因真核细？…

本实验构建了人野生型Ｐ５３基因与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的重组体,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础,方法：利用分子生物学基固然我隆技术从质粒ｐＧＥＸ＾－ｐ５３中用双酶切下目的片段,挤压法回收与ｐｃＤＮＡ３构成重组体。结果成功的构建了人野生型Ｐ５３基因真核细胞表达质粒。     

重组P_(53)基因转染的肝癌细胞克隆株的建立及其生物学活性观察

人Ｐ５３基因位于１７ 号染色体短臂上（１７ｐ１３．１） ,编码一个由３９３ 个氨基酸组成的核磷酸蛋白,有调控细胞的生长,维持基因组的稳定,其突变、缺失在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为进一步探讨野生型Ｐ５３ 基因的抗肿瘤特性,我室采用分子克隆方法构建了重组野生型Ｐ５３ 真核表达载体（ｐｘＴ１—Ｐ５３） ,用磷酸钙—ＤＮＡ 共沉淀法将其导入人肝癌ＨｅｐＧ ２ 细胞内,通过标记基因ＮｅＯＲ 筛选带外源Ｐ５３ 基因的Ｇ４１８ 抗药性克隆,对Ｇ４１８ 抗药性克隆细胞的生长增殖和粘附能力进行观察。结果表明,导入野生型Ｐ５３基因能使肝癌ＨｅｐＧ ２ 细胞的生长增殖速度较对照细胞明显减慢,细胞粘附能力下降。提示野生型Ｐ５３ 基因能抑制肝癌细胞的生长。本研究为肝癌的Ｐ５３ 实验性基因治疗提供了一定的依据。     

重组P53基因转染的肝癌细胞克隆株的建立及其生物学活性观察

人Ｐ５３基因位于１７ 号染色体短臂上（１７ｐ１３．１） ,编码一个由３９３ 个氨基酸组成的核磷酸蛋白,有调控细胞的生长,维持基因组的稳定,其突变、缺失在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为进一步探讨野生型Ｐ５３ 基因的抗肿瘤特性,我室采用分子克隆方法构建了重组野生型Ｐ５３ 真核表达载体（ｐｘＴ１—Ｐ５３） ,用磷酸钙—ＤＮＡ 共沉淀法将其导入人肝癌ＨｅｐＧ２ 细胞内,通过标记基因ＮｅＯＲ 筛选带外源Ｐ５３ 基因的Ｇ４１８ 抗药性克隆,对Ｇ４１８ 抗药性克隆细胞的生长增殖和粘附能力进行观察。结果表明,导入野生型Ｐ５３基因能使肝癌ＨｅｐＧ２ 细胞的生长增殖速度较对照细胞明显减慢,细胞粘附能力下降。提示野生型Ｐ５３ 基因能抑制肝癌细胞的生长。本研究为肝癌的Ｐ５３ 实验性基因治疗提供了一定的依据。     

野生型P53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的；观察野生型Ｐ５３对胃癌细胞系的生长抑制作用，方法，以逆转录病毒为载体将野生型Ｐ５３基因导入胃癌细胞系ＭＫＮ２８和ＢＧＣ８２３，检测Ｐ５６３对肿瘤细胞的影响。结果：Ｐ５３在转染细胞中表达水平提高，外源性Ｐ５３的导入使肿瘤细胞增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）水平明显降低；Ｇ０／Ｇ１期细胞数增加，Ｓ期降低。转染Ｐ５３基因的ＭＫＮ２８细胞裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论野生型Ｐ５３基因在与调节ＤＮＡ复制及细胞     

含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建一种双基因真核表达载体，使之表达人突变型p53蛋白(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)，为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础。方法通过基因重组技术，构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用脂质体LipofectAMINE^TM 2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中，转染后48h，采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达。结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析，结果与预期相符合：转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达。结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒LMP1的真核载体pLMP1-p53mt，其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴。     

逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。     

甲胎蛋白启动子调控表达p53基因的肝癌细胞靶向性基因治疗？…

目的 利用含有人甲胎蛋白启动子的腺相关病毒载体,构建能在人肝癌细胞株中特异表达目的的基因的质粒。方法 通过设计含有特定酶切点位点的引物,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋启动子（ＡＦＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）主列并克琶含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ报基因的质粒,ｐＲＴ－ＵＦ５上,构建成含报告基因的重组腺相关病毒质粒ｒＡＡＶ－ＡＦＰ－ＧＦＰ转染表达ＡＦＰ的Ｈｅｐ Ｇ２细胞株和不表达ＡＦＰ的２９３因的质粒ｒＡＡ     

肿瘤抗原P1A与细胞因子mGM-CSF共表达载体的构建和表达

目的：构建并鉴定细胞因子mGM-CSF和肿瘤特异抗原PIA共表达载体，为研究新型的肿瘤疫苗提供新的策略。方法：以PCR方法从pCI-neo／PIA中扩增出PIA编码基因片段，构建于pRSC质粒上；再从pORF-mGM-CSF中扩增出mGM-CSF基因片段．插入pRS-PIA重组质粒PIA基因的上游。以酶切和DNA测序进行鉴定。并将鉴定过的重组质粒以脂质体法转染7721细胞．用RT-PCR法鉴定转染细胞中PIA基因和mGM-CSF基因的表达。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实mGM-CS17和PIA重组质粒构建正确，并在转染此质粒的7721细胞中检测出了PIA和mGM-CSF基因的表达。结论：成功构建mGM-CSF和PIA的共表达载体，为研制新型肿瘤疫苗奠定了基础。     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

Construction of retrovirus vector with HBV Pol gene and its expression invitro

Objective: To construct retroviral vector with HBV Pol gene and study its expression in vitrn. Methods: The recombinant plasmid HBV2/pBR322 containing 2 copies of HBV full-length gene was provided as the amplification template. The PCR product was cloned into pMD 18-T and subeloned into pMSCVneo and pLNCX2 to construct the recombinantret roviral vectors with HBV Pol gene named by HBV P/pMSCVneo and HBV P/pLNCX2. HBV Pol gene was detected by RTPCR after transfecting the recombinant plasmids into SMMC7721 cells with liposome and G418 selection. Results: The retroviral vector with HBV Pol gene was successfully constructed and the expression of HBV Pol gene in vitro was detected by RTPCR. Conclusion: The retroviral vector with HBV Pol gene can be obtained, which will provide a new insight on the function of HBV Pol gene.     

HnPNPB1基因短发夹环RNA载体的构建与鉴定

目的 利用RNA干扰（RNA interfering，RNAi）技术，构建HnRNPB1表达载体，并进行鉴定。方法 采用H1启动子，分别把被7bP序列间隔的21bp长短的HnRNPB1靶序列的反向重复序列，置于PsiRNA-hH1neoG2质粒中，分别构建HnRNPB1短发夹环RNA（shRNA），产生重组质粒PSiRNA—hHl neoG2 HnRNPB1。结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，并作测序分析，经测序鉴定确定为所需序列。结论 针对HnRNPB1基因的特异性ShRNA真核表达载体PSiR—NA—hH1 neoG2 HnRNPB1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下基础。     

抑制人喉癌细胞生长的p53基因反转录病毒重组体的构建

野生型ｐ５３基因在细胞增殖与分化的调控过程中起着重要作用。已有研究表明，人喉癌中存在ｐ５３基因的结构异常或表达异常。本实验根据这一特点，设计出能整合在人喉癌细胞染色体上并适宜表达的野生型ｐ５３基因反转录病毒重组体Ｐｃ５３Ｎ２Ａ。通过体外实验证明，这一重组体能够以基因替代的方式，恢复ｐ５３基因的功能，抑制人喉癌细胞的生长。