多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌

目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的最低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.     

巢式多重聚合酶链反应在腺病毒检测及分型中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的腺病毒检测及分型方法。方法根据编码腺病毒六邻体基因的核苷酸序列设计一对外引物（即通用引物），扩增产物为1278bp；再分别设计针对腺病毒六邻体基因3、7、11和21型特异性序列的4对内引物，扩增产物分别为502、311、880和237bp。应用多重巢式聚合酶链反应（nest—PCR）技术将这4对引物用于同一聚合酶链反应管中，根据扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上的大小，即可鉴别所测毒株的型别。结果3、7、11和21型腺病毒标准株和分离株分别产生预期的特异性扩增片段，与其他常见的呼吸道病毒等无交叉反应。118份经病毒分离和／或间接免疫荧光法确定为腺病毒阳性的急性呼吸道感染患儿临床标本中，腺病毒3型占64．4％（76／118），7型占31．4％（37／118），11型占2．5％（3／118），未检测到21型；2份病毒分离和间接免疫荧光均为腺病毒阳性的标本中，用该方法未能鉴定出型别，可能是3、7、11、21型以外的腺病毒，占1．7％（2／118）。33份经病毒分离和／或间接免疫荧光法均未检测到腺病毒的标本中，有3份为PCR阳性（包括1份7型，2份3型）。结论该方法鉴别3、7、11、21型腺病毒具有快速、简便、特异等特点，适用于腺病毒型别鉴定，可以为急性呼吸道感染的临床或群体公共卫生事件提供病原学诊断依据。     

细菌性脑膜炎多重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立8种细菌性脑膜炎多重聚合酶链反应(Multiplex-polymerase Chain Reaction M-PCR)检测方法。方法针对脑膜炎奈瑟菌、流行性感冒嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、猪链球菌、结核杆菌、新生隐球菌的种特异性基因,通过优化单一PCR扩增体系及扩增程序,建立M-PCR方法检测8种导致细菌性脑膜炎的病原体,检测M-PCR体系的灵敏度。结果初步建立了检测8种导致细菌性脑膜炎病原体的M-PCR扩增方法,能够同时检测多种导致细菌性脑膜炎的病原。结论M-PCR方法较常规的分离培养鉴定方法具有较高的灵敏度和检测快速的特点,适合临床疑似细菌性脑膜炎感染病例的检测及筛查,提高临床细菌性感染脑膜炎病例的诊断阳性率。     

多重聚合酶链反应检测女性生殖道病毒感染

应用多重聚合酶链反应(PCR)检测了女性生殖道单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒和巨细胞病毒。结果显示:在健康体检200例中,9例为阳性(4.50％);门诊病人712例中,142例为阳性(19.94％)。多重PCR具有一次可检测多重病原,且速度快、敏感和特异的优点,非常适用于临床检测女性生殖道病毒感染。     

聚合酶链反应检测军团菌的国外研究进展

聚合酶链反应检测军团菌的国外研究进展北京市卫生防疫站（１０００１３）彭晓（综述）中国预防医学科学院流行病学与微生物学研究所万超群（审校）军团菌广泛存在于自然环境中，通过呼吸道感染方式引起人类严重的不典型肺炎，其中由嗜肺军团菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａｐｎ...     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

四种食源性病毒多重反转录-聚合酶链反应检测研究

目的 建立同时检测诺如病毒、轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒多重RT-PCR检测方法.方法 以四种食源性病毒的高度保守区为靶序列设计特异引物,优化反应体系和条件,确定多重RT-PCR检测四种病毒的特异性和灵敏度,并初步应用于临床样本中四种病毒的同时检测.结果 在灵敏度试验中得到的轮状病毒、诺如病毒和星状病毒稳定的最高检测限均为50 pg/ml,甲肝病毒为100 pg/ml.在128份临床粪便样本中,其中轮状病毒阳性62份(48.44%),诺如病毒阳性8份(6.25%),星状病毒阳性11份(8.59%),甲肝病毒阳性4份(3.12%).结论 研究所建立的多重RT-PCR方法,在实际应用中能同时处理大量的样本,提高PCR检测方法的能力,可以应用于临床病例的诊断和流行病学调查等研究.     

多重逆转录聚合酶链反应检测主要上呼吸道病毒

目的：建立用多重逆转录聚合酶链反应（mRT-PCR）检测甲1型、甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道全胞病毒（RSV）A型、B型等主要上呼吸道病毒的方法，以快速检测上呼吸道感染主要病毒及对甲型、甲亚型、乙型流感病毒在上海地区人群感染、流行情况设计。方法：采用经MDCK细胞接种培养的甲3型、乙型流感病毒和Hep-2细胞接种培养的RSV A型、B型标准毒株病毒液，以及甲1型、甲3型、乙型流感病毒和RSV A型、B型混合毒株病毒液，使用5组引物，分别为HA1-5al和Hal-3al（甲1型流感病毒）、HA3-5al和HA3-3al和HA3-3al（甲3型流感病毒）、NP-5b1和NP-3bl（乙型流感病毒）、RSVAF和RSVAR(RSVA型)、RSVBF和RSVBR(RSVB型)，经mRT-PCR，琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察上述病毒特异核苷酸条带。结果：甲1型、甲3型、乙型流感病毒，RSVA型、B型分别在431，210，390，334，183bp处出现清晰的5条DNA条带。结论：应用5组引物，mRT-PCR可用于快速检测临床上呼吸道感染标本中的流感病毒和RSV，并可对其进行分型，对上呼吸道病毒感染性疾病的诊断和流感的监测方面是非常重要的。     

对套式多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒核酸效果的评价

用套式多聚酶链反应和普通ＰＣＲ法检测丙型肝炎病毒核酸比较。ＮＰＣＲ溴化乙锭染色法结果与＾Ｐ标记探针核实结果完全一致，无漏检，也无假阳性，可不用＾Ｐ标记探针核实。ＮＰＣＲ法的敏感性为普通ＰＣＲ溴化乙锭染色法的２倍，为普通ＰＣＲ加探针法的１．１７倍。     

PCR技术检测尿中人巨细胞病毒的方法学研究

应用ＨＣＭＶ早、晚期两对ＤＮＡ引物，建立了聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测尿中人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）的方法。肾移植术后ＨＣＭＶ感染的临床尿样检测结果表明，该方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点，与血清ＨＣＭＶ－ＩｇＭ检测结果符合率为８３．３％。使用早、晚期基因组的双引物分别对临床尿样进行ＰＣＲ扩增，减少了由于自然点突变所致的假阴性，且引物与ＨＣＭＶ同属其它病毒及组织ＤＮＡ间无交叉反应；以ＨＣＭＶ组织培养液作模板，灵敏度可达６２５ｆｇ。本方法为诊断肾移植受者ＨＣＭＶ感染提供了新的手段，适于临床推广。     

用多引物聚合酶链反应检测鼠疫耶尔森菌

目的建立多引物检测鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的PCR（M-PCR）方法.方法合成4对引物,分别来源于质粒和染色体DNA上F1、pla、Hms、Inv基因,对164株鼠疫菌进行扩增.结果在164株鼠疫菌中,有152株菌4种基因扩增均阳性,仅云南省12株Hms基因扩增为阴性.结论采用M-PCR方法检测鼠疫菌DNA具有较好的敏感性、特异性和稳定性,其可作为检测与鉴别鼠疫菌和疫情监测方面快速诊断的方法.     

聚合酶链反应直接检测粪便中脊髓灰质炎病毒RNA的研究

用聚合酶链反应技术检测１９分急性弛缓性麻痹患者的粪便中脊髓灰质炎病毒，其中１１份阳性，与中和试验鉴定及单克隆抗体鉴定结果符合率为９０．９０％￣１００％。该法不仅简便，敏感，特异分型，而且可作型内鉴别，为环境样品中脊灰病毒污染提供了检测手术。     

复式PCR检测疟原虫的应用研究

[目的 ]建立适合于疟疾流行区现场应用的复式 PCR检测系统。 [方法 ]采用生理盐水处理样本 ,设计针对恶性疟原虫 (P.f) p BPK1- 14基因和间日疟原虫 (P.v)线粒体细胞色素 C氧化酶基因 CO 合成引物 ,混合一次扩增检测P.f 和 P.v。[结果 ]P.f 及 P.v模板分别被扩增出一条 2 10 bp和 370 bp的片段 ,与食蟹猴疟原虫 (P.c)、鼠伯氏疟原虫(P.b)及正常人白细胞无交叉 ,且可检测不同地理株的 P.f 和 P.v,P.f 和 P.v的敏感度分别为 5 .5× 10 - 7和 1.5×10 - 6 ,检测 146份疟区发热病人 ,与镜检结果相比 ,其敏感性和特异性 P.f为 97.9%和 98.7% ,P.v为 10 0 %和 98.7%。[结论 ]该复式 PCR检测系统适应于现场疟疾流行病学监测 ,防治效果考核 ,疑似疟疾病人的诊断及虫种鉴定。     

嗜肺军团菌聚合酶链反应检测方法及其应用研究

根据嗜肺军团菌基因组ＤＮＡ的种特异性ＤＮＡ片段序列，合成一对引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。经琼脂糖凝胶电泳、ＥＢ染色结果表明，一条８７０ｂｐ的核苷酸区带为嗜肺军团菌１～１４血清型菌株所共有。ＰＣＲ检测水中军团菌，其敏感性为３５０ｃｆｕ／ｍｌ，而用同位素标记探针、斑点杂交法检测，其敏感性为４３ｃｆｕ／ｍｌ。ＰＣＲ检测人工感染嗜肺军团菌的豚鼠组织标本，阳性率为８３．３％，而细菌分离培养的阳性率仅为２６．６％。在现场调查中，用ＰＣＲ法初步验证了一起由Ｌｐ１０引起的军团菌病爆发。上述结果表明，ＰＣＲ法能快速、敏感、特异性检测嗜肺军团菌感染。     

Multiplex Real-time Polymerase Chain Reaction Assays for Simultaneous Detection of Vibrio cholerae,Vibrio parahaemolyticus,and Vibrio vulnificus

ObjectivesA multiplex real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) method was developed for the identification of three Vibrio species: Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and Vibrio vulnificus.MethodsSpecific primers and probes targeting the hlyA, tlh, and vvhA genes were selected and used for multiplex real-time PCR to confirm the identification of V. cholerae, V. parahaemolyticus, and V. vulnificus, respectively. This method was applied to screen Vibrio species from environmental samples and combining it with a culture-based method, its effectiveness was evaluated in comparison with culture-based methods alone.ResultsSpecific PCR fragments were obtained from isolates belonging to the target species, indicating a high specificity of this multiplex real-time PCR. No cross-reactivity with the assay was observed between the tested bacteria. The sensitivity of the multiplex real-time PCR was found to have a lower limit of 10⁴ colony-forming units/reaction for all three Vibrio species. The combination strategy raised the isolation ratio of all three Vibrio species 1.26- to 2.75-fold.ConclusionThis assay provides a rapid, sensitive, and specific technique to detect these three Vibrio species in the environment.     

PCR技术检测血液中和蚊体内班氏丝虫的研究

目的　寻找一种敏感、特异的班氏丝虫病的检测方法。方法　根据班氏丝虫SspI重复序列 ,合成班氏丝虫特异性引物一对 ;运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微丝蚴和蚊体内幼丝虫 ,并将此技术应用于原班氏丝虫流行区的疾病监测。结果　该方法可检出 1 0 0 μl阳性血样中的 1条班氏丝虫微丝蚴 ;5 0只致倦库蚊中含有一只仅感染 1条班氏幼丝虫阳性蚊亦能准确检出。马来丝虫等其它寄生虫样本的PCR结果均为阴性。用该方法检测广东省班氏丝虫监测点 5 4 0份血液样本和 1 4 70 8只致倦库蚊样本 ,所有样本均为阴性。结论　该PCR反应系统灵敏度高、特异性强 ,可作为一种新的班氏丝虫病监测方法在现场中使用     

应用PCR检测环境水体中的嗜肺军团菌

目的　建立检测Mip基因的PCR方法,以检出环境水体中的嗜肺军团菌。　方法　采用Godkey软件设计引物,制备菌种模块,对模拟和环境水样进行处理,然后作PCR扩增及其产物检测。　结果　该方法检测军团菌的灵敏度为5 .8×10 2 cfu/ml,6株标准军团菌均扩增出65 0bp的条带,4株非嗜肺军团菌和4株非军团菌无条带出现;检测71份环境水样,5份阳性,阳性率为7.0 %。　结论　该方法快速、灵敏、特异,为水体中的嗜肺军团菌检测提供了有效方法