人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

带有Flag标签的ZNF580真核表达载体的构建及扩增

目的 构建并扩增带有Flag标签的ZNF580真核表达载体,用于免疫共沉淀实验.方法 pGB-ZNF580质粒进行SfiI酶切,琼脂糖电泳,切胶并纯化回收ZNF580片段,与同样酶切的真核表达载体pCDEF-Flag连接构建重组质粒pCDEF-Flag-ZNF580.重组质粒转化细菌感受态,铺于氨苄抗性LB平板,37℃培养箱过夜,挑取转化了重组质粒的单克隆接种于液体LB培养基中摇床培养4～8h.从大肠杆菌中提取质粒酶切鉴定及送Takara公司测序鉴定.结果 成功构建重组质粒pCDEF-Flag-ZNF580并转化细菌感受态,于大肠杆菌中扩增得到足够用于细胞转染和免疫共沉淀实验的重组质粒,Takara测序结果显示重组质粒序列完全正确.结论 成功构建和扩增了重组质粒pCDEF-Flag-ZNF580,为后续进行真核细胞的转染及免疫共沉淀实验奠定了基础.     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的 构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达.方法 根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆.对经PCR、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的 片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证.脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT-PCR验证该基因的表达.结果 PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT-PCR的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达.结论 成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备.     

凋亡素基因质粒载体对人肝癌细胞的影响

目的探讨凋亡素基因表达对人肝癌细胞的影响。方法将凋亡素基因克隆入真核表达载体pEGFP-C2,构建成pEGFP-VP3 为了使EGFP和EGFP-VP3在人肝癌细胞中表达,用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染人类肝癌细胞系(HepG2),通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达、细胞生长及凋亡,用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。结果在HepG2/EGFP组细胞中,EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核,细胞形态无变化。与非转染细胞的自然凋亡相比,转染细胞中细胞凋亡没有增加。在HepG2/EGFP-VP3组细胞中,EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核,细胞核中EGFP-VP3颗粒逐渐变粗,细胞变得小而圆,最后成为碎片,Annexin V-PE染色显示细胞凋亡;HepG2/EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于HepG2/EGFP组和HepG2组(P<0.01)。结论 pEGFP-VP3转染人肝癌细胞后,凋亡素基因表达并导致癌细胞凋亡。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CTP基因真核表达载体的构建

目的构建恶性疟原虫CTP 基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank 已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3. 结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中. 结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功.     

人CD40 ligand基因真核表达质粒的构建及对人肝癌细胞HepG2的促凋亡作用

目的:构建含人CD40ligand(CD40L)基因的真核表达载体,并使之在人肝癌细胞HepG2中表达,研究CD40L稳定表达对HepG2细胞的影响.方法:从人外周血单个核细胞总RNA中经RT-PCR扩增出人CD40L基因,经过酶切连接进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A制备重组质粒.重组质粒经酶切及测序证实人CD40L基因成功克隆进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A,并进一步转入大肠杆菌(E.coliDH5a)大量扩增.实验分4组,A组HepG2细胞转染重组质粒,B组HepG2细胞转染不含CD40LcDNA的空质粒,C组HepG2细胞正常培养,D组HepG2细胞加入G418作为转染对照.RT-PCR及流式细胞术鉴定A,B,C3组细胞表面CD40L和CD40的表达后,A,B,C3组细胞分别设6个复孔培养72h后,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达.结果:测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功.流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7%,CD40表达为15.4%;B和C组细胞表面仅有CD40表达,分别为31.7%和28.5%.A组细胞凋亡率45.0±0.3%,B,C组均未发生明显凋亡(P<0.01).与C组细胞比较,A组细胞周期分布主要阻滞在G1期(90.4±1.3%vs60.6±1.5%,P<0.01),S期(6.32±1.0%vs12.0±0.7%)和G2/M期分布(3.3±0.7%vs27.3±1.2%)均有减少(P<0.01).A组细胞Fas表达率(27.8±1.5%)较B组(3.2±0.8%)和C组(4.2±1.0%)明显上调(P<0.01).结论:我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达,CD40L对于HepG2细胞具有促凋亡的作用,这可能与CD40L-CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调和细胞周期阻滞有关.     

hPOT1基因正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1）基因的正、反义真核表达载体，以进一步研究hPOT1蛋白的功能及作用机制。方法用限制性内切酶将hPOT1 cDNA从pLPCNMyc POT1质粒上切下来，经适当改造后以正、反方向插入到质粒pcDNA3．1（-）中，构建hPOT1基因的正、反义真核表达载体；用PCR、酶切及DNA测序的方法鉴定hPOTI基因正、反义表达载体序列和方向的正确性。结果PCR、酶谱分析及DNA测序结果表明hPOT1正，反义真核表达载体序列和方向正确。结论成功地构建了hPOT1正、反义真核表达载体，为进一步研究hPOT1在端粒保护，细胞衰老和凋亡中的作用奠定了基础。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

TSA对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及FHIT表达的影响

目的观察曲古抑菌素A（TSA）的体外抗人肝癌HepG2细胞作用及机制。方法取人肝癌HepG2细胞培养至对数生长期后随机分为TSA组、对照组、空白组,TSA组加入TSA至终浓度分别为125、250、500、1 000、2 000nmol/L,对照组加入等量二甲基亚砜（DMSO）,空白组只加培养基、无细胞,每组设6个复孔,作用24~72 h后MTT比色法测定HepG2细胞增殖抑制率（IR）,倒置显微镜和电镜观察HepG2细胞形态变化,TUNEL法检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测脆性组氨酸三联体（FHIT）基因表达,Western blot检测FHIT蛋白表达。结果与对照组相比,TSA组IR随TSA浓度增加和作用时间延长而增加（P〈0.05）,透射电镜下TSA组HepG2细胞出现凋亡早期改变;与对照组比较,TSA组细胞凋亡率升高,FHIT mRNA及蛋白表达增强（P均〈0.01）。结论 TSA体外能有效抑制肝癌细胞株HepG2生长并促进其凋亡,机制可能为上调FHIT表达。     

VEGF真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建血管内皮生长因子（vascu lar endothelial growth factor,VEGF）真核表达载体,并研究其在骨髓间充质干细胞（m esenchym al stem cells,MSCs）中的表达情况。方法运用DNA重组技术,构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,将载体转染大鼠MSCs,RT-PCR,ELISA及免疫细胞化学等方法检测VEGF在大鼠MSCs中的表达情况,MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF的生物活性。结果成功构建VEGF真核表达载体pcDNA3.1（-）/hVEGF165,其转染后的大鼠MSCs中VEGF表达水平明显增高,转染后细胞培养上清液具有促使内皮细胞增殖的生物活性。结论VEGF真核表达载体转染大鼠MSCs后能有效增加VEGF表达,并表现出较强的促内皮细胞增殖作用。     

顺铂和苦参素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响

观察顺铂、苦参素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响,进一步探讨两种药物的可能作用机制。采用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的药物对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;PCR-ELISA法检测端粒酶活性的变化。两种药物均具有抗HepG2细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导凋亡及抑制端粒酶活性的作用。对端粒酶活性的抑制可能是两种药物发挥抗肿瘤作用的机制之一。     

Construction of eukaryotic expression vector of HBV x gene

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＣｈｒｏｎｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕ...     

人白细胞介素10真核表达载体的构建及表达

目的 建立人白细胞介素10(hIL-10)真核表达系统并观察其在HeLa细胞中的表达。方法 用RT-PCR方法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hIL-10 cDNA，将其克隆至pMDl8-T中，测序正确后，再定向插入真核表达载体pCIneo中，经脂质体介导转染HeLa细胞，检测其在细胞内外的表达和分泌。结果 RT-PCR扩增的hIL-10 cDNA序列与GenBank中hIL-10 cDNA序列一致；构建了真核重组表达载体pCIneo-hIL-10；转染HeLa细胞后可检测到hIL-10的转录和表达。结论 成功构建了hIL-10真核表达系统，为今后的临床研究及基因工程药物的生产奠定基础。     

原花青素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的作用

目的探讨葡萄籽提取物原花青素（PA）对人肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响。方法取对数生长期人肝癌细胞SMMC-7721,分别加人20、40、60mg／L的PA培养24h后,采用MTI＂法检测细胞增殖抑制率、流式细胞仪分析细胞凋亡率,并测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）和活性氧簇（ROS）等指标。结果20、40、60mg／L的PA对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率分别为（22．7±1．8）％、（38．6±1。9）％、（47．6±2．5）％,细胞凋亡率分别为（19．7±5．1）％、（29．7±2．9）％、（48．5±4．5）％,两者均随PA浓度的升高而增高（P均〈0．01）;与对照组比较,各剂量组人肝癌细胞SMMC-7721中MDA、ROS水平逐渐下降（P〈0．05）;SOD活力逐渐上升（P〈0．05）。结论PA在体外可呈浓度依赖性抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖及凋亡,其作用机制可能与清除ROS、提高SOD的活性、降低脂质过氧化反应等有关。     

人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.