小RNA干扰Akt2对U87恶性胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨转染Akt2-siRNA表达载体阻断Akt2信号转导通路对U87恶性胶质瘤细胞运动、迁移和侵袭能力的影响. 方法 利用siRNA技术,稳定转染恶性胶质瘤细胞系U87;用RT-PCR和免疫印迹技术分别检测Akt2的mRNA和蛋白的表达;划痕实验和体外侵袭实验分别检测恶性胶质瘤细胞的运动和侵袭能力;用细胞黏附实验检测细胞的黏附能力,纤维型肌动蛋白(F-actin)聚合实验检测F-actin的聚合能力;免疫印迹技术检测LIMK的磷酸化,证明Akt2影响F-actin聚合的机制. 结果 稳定转染siAkt2载体后,Akt2的mRNA和蛋白水平均下降;细胞向划痕移动的速度比对照组慢(P<0.05);侵袭并穿透基质胶(Matrigel)的细胞数量比对照组少(P<0.01);细胞内F-actin聚合比对照组减少(P<0.05);黏附实验结果显示,黏附5min、15min后,低表达Akt2的细胞比对照组的黏附数量均减少(P<0.05). 结论 Akt2基因沉默可以通过降低F-actin聚合、降低黏附于细胞外基质的能力而降低恶性胶质瘤细胞的运动和侵袭能力.     

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的:研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白(OPN) RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法:应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体(LV-OPN shRNA)感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果:与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论:慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.     

下调CENP-W对人脑胶质瘤U87细胞的影响

目的:研究下调着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)的表达水平对人脑胶质瘤U87细胞的影响。方法:采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人脑胶质瘤U87细胞CENP-W的表达,采用RT-qPCR和Western blot法评价siRNA的干扰效果,采用MTT法、BrdU实验和平板集落形成实验测定细胞的增殖,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:MTT实验、平板集落形成实验和BrdU实验显示转染siRNA的实验组U87细胞的增殖能力、集落形成能力较空白对照组及阴性对照组明显降低;Transwell实验和划痕实验显示实验组细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组及阴性对照组明显减弱;流式细胞术分析表明实验组细胞的细胞周期被阻滞在G_0/G_1期;实验组细胞凋亡比例较对照组增多(P0.05)。结论:下调CENP-W的表达可抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞的凋亡,提示CENP-W有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

小干扰RNA敲低Dicer对人脑胶质瘤细胞生物学特征的影响

目的 研究敲低Dicer酶的表达全面抑制徽小RNA(microRNA,miRNA)成熟对TJ905人脑胶质瘤细胞的生物学特征的影响.方法 采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低Dicer酶的表达,逆转录PCR、Western印迹及免疫荧光检测TJ905细胞转染小干扰RNA(small interferen,siRNA)后Dicer酶表达情况;应用流式细胞术检测、噻唑兰比色分析法试验及Tranwell试验评价细胞生长、增殖和侵袭等生物学特征变化.结果 转染siRNA靶向Dicer酶后,Dicer酶被敲低,S期细胞增多,细胞增殖加速,细胞侵袭生长能力增强.结论 敲低Dicer酶全面抑制miRNAs成熟后,肿瘤细胞表型具有更为恶性变的倾向,由此初步推测全面抑制细胞miRNAs表达有可能促进肿瘤生成.     

慢病毒介导的RWDD3沉默对人胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

ATP1A1基因沉默抑制人胶质瘤细胞U251侵袭

目的探讨沉默Na+/K+ATP酶A1亚基(ATP1A1)对人U251胶质瘤细胞系侵袭能力的影响及其机制。方法用shRNA-ATP1A1慢病毒感染人U251胶质瘤细胞,RT-q PCR及Western blot分别检测ATP1A1 mRNA和蛋白的表达;MTT法检测细胞体外的增殖;细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达。结果沉默ATP1A1细胞的ATP1A1 mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制;细胞的增殖和迁移、侵袭能力也显著受抑(P0.05);MMP-2和MMP-9的表达也明显降低(P0.05)。结论靶向ATP1A1干扰能够明显抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、迁移及侵袭,其机制可能与MMP-2、MMP-9的下调相关,ATP1A1可能作为胶质瘤治疗的一个潜在靶点。     

骨桥蛋白RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞作用的研究

目的研究OPN特异性RNA干扰对人卵巢癌SKOV3细胞的影响。方法针对OPN cDNA设计3条siRNA,用Lipofectamin 2000转染卵巢癌SKOV3细胞,用RT-PCR检测siRNA对OPN基因的沉默效果;用Western blot检测siRNA对细胞中OPN蛋白表达的影响;利用Hochest 33258检测siRNA诱导SKOV3细胞凋亡的作用。结果 siRNA能明显降低卵巢癌SKOV3细胞中OPN mRNA和蛋白的表达,3个siRNA转染组中siR-NA3组对OPN基因的抑制效果最为明显,siRNA3能显著增加SKOV3细胞的凋亡。结论靶向OPN的siRNA能在体外有效抑制OPN的表达,可用于卵巢癌的基因治疗。     

青藤碱抑制人脑胶质瘤U251细胞的侵袭迁移能力

目的探讨青藤碱对人脑胶质瘤U251细胞的侵袭迁移能力的抑制作用。方法采用0.1mM,0.2mM,0.4mM,0.8mM以及1mM的青藤碱作用人脑胶质瘤U251细胞,作用24、48、72 h后,采用CCK-8法检测其吸光度值,计算细胞活力;采用Transwell实验检测U251细胞迁移侵袭能力;采用Western blot法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白表达水平。结果青藤碱以剂量和时间依赖方式抑制细胞增殖;与对照组相比,0.2mM,0.4mM,0.8mM以及1mM的青藤碱分别显著抑制细胞增殖(P0.01)。与对照组相比,青藤碱显著抑制U251细胞的迁移能力和侵袭能力,显著降低U251细胞内MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平(P0.01)。结论青藤碱抑制U251细胞迁移和侵袭能力与降低U251细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达水平相关。     

沉默c-myc基因对Jiyoye细胞增殖与凋亡的影响

目的 运用RNA干扰（RNAi）技术,探讨经慢病毒载体介导的小干扰RNA（siRNA）转染Jiyoye细胞对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供体外实验依据。方法 设计、合成一对针对c-myc基因的c-myc-3寡聚核苷酸链和一对阴性对照c-myc- neg寡聚核苷酸链。退火,然后连接到pLVX干扰载体上,包装,慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株。转染后培养72 h,流式细胞术检测各组细胞转染率,pLVX-c-myc-3转染Jiyoye细胞,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化吡啶（FITC/PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 ①转染72 h后,流式细胞术鉴定阳性细胞比例,c-myc-neg组与c-myc-3组比较,差异无统计学意义（P 〉 0.05）[（54.3 ± 4.2） % vs（52.8 ± 2.9） %];两组细胞平均荧光强度差异、细胞转染率差异无统计学意义。②转染168 h生长曲线显示,转染pLVX-c-myc实验组细胞生长缓慢,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组细胞抑制率为（46.40 ± 1.41） %,阴性对照组细胞抑制率为（17.03 ± 1.32） %,差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。③转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组早期凋亡细胞比例（25.6 ± 4.2） %,阴性对照组早期凋亡细胞（15.1 ± 4.2） %,空白对照组早期凋亡细胞为（12.7 ± 1.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。实验组晚期凋亡细胞比例（11.5 ± 4.7） %,阴性对照组为（9.3 ± 4.7） %,空白对照组为（8.14 ± 2.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。结论 设计合成构建的干扰序列pLVX-c-myc-3,可沉默c-myc基因,抑制Jiyoye细胞增殖,诱导细胞凋亡,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用提供了实验依据。     

Adsorption of miR-218 by lncRNA HOTAIR regulates PDE7A and affects glioma cell proliferation,invasion, and apoptosis

Objective: To evaluate the role of targeted adsorption of miR-218 by long-chain non-coding RNAHOTAIR to regulate PDE7A on glioma cell proliferation, invasion, and apoptosis. Methods: The expressions of lncRNA HOTAIR, miR-218, and PDE7A in glioma tissues and normal parcancer tissues, NHA and glioma cell lines were determined, and correlations among the three genes were analyzed. The subcellular localization of lncRNA HOTAIR was determined by fluorescent in situ hybridization. Dual-luciferase reporter assay was used to validate the targeted relationship between lncRNA HOTAIR/miR-218/PDE7A. Glioma cells were grouped to receive intervention of lncRNA HOTAIR or miR-218. MTT, transwell, and flow cytometry were performed to determine the proliferation, invasion, and apoptosis of cells. Results: Compared with the normal tissues and cells, the expression of lncRNA HOTAIR was increased while miR-218 was suppressed in glioma tissues samples and cells (all P<0.05). Inhibition of lncRNA HOTAIR expression, was able to induce apoptosis and suppress the proliferation and invasion of cells (all P<0.05). LncRNA HOTAIR is mainly localized in the cytoplasm, and is able to adsorb miR-218 as ceRNA. The effect of knockdown of HOTAIR on glioma cells could be partially rescued by miR-218 inhibitor. The expression of PDE7A was enhanced in glioma tissues and cells compared to normal tissues and cells (all P<0.05), which positively correlated with the expression of HOTAIR (r=0.546, P<0.05) and negatively correlated with the expression of miR-218 (r=0.363, P<0.05). The targeted relationship between miR-218 and PDE7A was validated: Overexpression of miR-218 was able to suppress the proliferation and invasion of glioma cells and restrain apoptosis compared to the miR-NC group (all P<0.05). The effect of miR-218 on glioma cells could be partially rescued by PDE7A. Conclusion: lncRNA HOTAIR can adsorb miR-218 to regulate expression of PDE7A and promote the malignant biologic behavior of glioma cells.     

沉默URG11基因对前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移与侵袭的影响

 目的: 观察上调基因11(up-regulated gene 11,URG11)在前列腺癌细胞系中的表达及降低URG11表达对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和侵袭能力的影响。方法: 用real-time PCR和Western blot检测前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白水平;设计针对URG11基因的siRNA靶序列,转染LNCaP细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,MTS测定LNCaP细胞增殖能力,划痕和侵袭实验评价LNCaP细胞迁移及侵袭能力。结果: 在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌细胞系和RWPE-1正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白表达水平存在显著差异,在前列腺癌细胞中URG11 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,转染URG11 siRNA的LNCaP细胞增殖停滞在G₁/S期并诱导前列腺癌细胞凋亡,转染组的细胞凋亡率为8.79%±0.12%,而且LNCaP肿瘤细胞的迁移及侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论: URG11在前列腺癌系中高表达。通过RNAi沉默URG11基因能明显抑制LNCaP细胞增殖和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。     

Fibronectin-mediated cell migration promotes glioma cell invasion through chemokinetic activity

In order to investigate the biological role of fibronectin in glioma cell invasion, we studied the relation between migratory responses or adhesiveness of glioma cells to fibronectin and the in vitro invasion in three human malignant glioma cell lines, A172, T98G and U373MG. All these cell lines chemotactically migrated in a dose-dependent manner to fibronectin in concentrations ranging from 0.5 to 10 µg/ml, with A172 cells showing the strongest migration and U373 cells the weakest. Checkerboard analyses demonstrated that A172 and T98G cells showed much stronger chemokinetic responses to fibronectin than U373MG cells. In contrast to the migratory responses, A172 and U373MG cells showed an almost equally high adhesion to fibronectin and T98G cells a low adhesion. The degree of expression of the integrin 5 subunit correlated well with the strength of glioma cell adhesion to fibronectin rather than that of migration to the molecule. Furthermore, the cell adhesion to fibronectin was almost completely inhibited by arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-containing peptides, but the fibronectin-stimulated cell migration was only partially inhibited. An in vitro invasion assay disclosed that U373MG cells invaded the artificial basement membrane barrier the most and A172 cells the least. However, addition of fibronectin to the glioma cells markedly enhanced the invasive activity of A172 and T98G cells but had little effect on that of U373MG cells. These results indicate that fibronectin-stimulated migration can be one of the factors promoting invasiveness of glioma cells and that the chemokinetic activity of fibronectin may play a crucial role in glioma invasion through conferring motor-driving force on the glioma cells.     

沉默bim的表达对缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡的影响

 目的：探讨唯BH3域蛋白Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell  death)在缺氧所致大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法：在体外原代培养出生1~3 d的大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组：（1）正常对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+bim-siRNA组。倒置显微镜下观察心肌细胞的搏动频率和节律。全自动生化分析术检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,用MTT法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Western blotting 检测细胞Bim、 Bax、Bcl-2和p-p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的表达。结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。bim-siRNA转染均能有效沉默bim基因的表达（P<0.01）,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧使心肌细胞的搏动频率显著减慢,节律不规则,而沉默bim基因的表达能使细胞搏动频率增加。缺氧损伤导致细胞培养液中LDH含量较空白对照组明显增加（P<0.01）,心肌细胞存活率明显下降（P<0.05）,细胞凋亡率较空白对照组明显增加（P<0.01）,转染bim-siRNA后细胞培养液中LDH含量显著减少,细胞存活率升高,细胞凋亡率下降。缺氧损伤导致心肌细胞Bax和p-p38 MAPK表达升高（P<0.05或P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下降（P<0.01）,bim-siRNA的转染能够抑制缺氧导致的上述改变（P<0.01或P<0.05）,并且与心肌细胞凋亡发生率降低一致,p38 MAPK表达无明显变化。结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制Bax、p-p38 MAPK的表达和增强Bcl-2蛋白表达有关,这有望为冠心病的治疗提供新方向。     

骨形成蛋白4对人胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)对人胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响.方法 在体外以重组人BMP4蛋白干预人胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞,免疫荧光鉴定胶质瘤干细胞,通过软琼脂克隆实验、流式细胞仪检测,观察BMP4对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响.结果 BMP4能显著抑制胶质瘤干细胞的增殖能力,并诱导其凋亡.BMP4组增殖相关蛋白Cyclin D1 表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低,促凋亡蛋白Bax表达显著增多.结论 BMP4可显著抑制胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞的增殖能力,并诱导其凋亡.     

VE-statin/Egfl7 siRNA inhibits angiogenesis in malignant glioma in vitro

This study investigated the role of VE-statin/Egfl7 and its mechanism in angiogenesis in malignant glioma. Transwell culture plates were used to establish an U251-HUVEC co-culture system, which was used to mimic the interaction between malignant glioma and endothelial cells. Lentiviral vectors expressing VE-statin/Egfl7 siRNA were constructed, and U251 cells and HUVECs were transfected to inhibit VE-statin/Egfl7 expression. The proliferation, adherence, migration, and lumen formation of endothelial cells were assayed to investigate the influence of VE-statin/Egfl7 on angiogenesis in malignant glioma in vitro. Data showed that HUVEC growth was temporarily slowed after silencing the VE-statin/Egfl7 gene but rapidly returned to normal. Although endothelial cell migration was not influenced, cell adherence was markedly inhibited. Furthermore, the endothelial cells failed to generate a capillary-like lumen after VE-statin/Egfl7 gene silencing. Therefore, it can be concluded that VE-statin/Egfl7 may regulate the adherence of endothelial cells, thus playing an important role in endothelium-induced lumen formation during angiogenesis in malignant glioma.     

微管不稳定蛋白stathmin基因沉默影响鼻咽癌5-8F细胞系增殖与凋亡

目的: 构建微管不稳定蛋白stathmin基因siRNA质粒表达载体,探讨stathmin沉默对鼻咽癌5-8F细胞的增殖和凋亡作用。方法: 合成的stathmin基因特异性干扰片段单链退火形成双链后,亚克隆于siRNA质粒表达载体 pGenesil-1.1,质粒经鉴定后,采用脂质体将其转入鼻咽癌5-8F细胞;Western blotting检测stathmin表达;MTT实验分析细胞增殖;流式细胞术分析细胞凋亡。结果: Stathmin沉默组5-8F细胞的抑制率为(53.01±1.12)%,与试剂对照组 和阴性对照组 比较,差异显著(P<0.05)。Stathmin沉默组5-8F细胞的凋亡率为(8.75±0.67)%,与试剂对照组 和阴性对照组 比较,差异显著(P<0.05)。结论: Stathmin沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,诱导鼻咽癌5-8F细胞凋亡。