SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段原核表达载体的构建及表达

为构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段的原核表达载体，采用人工合成法合成SARS病毒E2蛋白3’端cDNA；用常规分子克隆方法将此cDNA片段克隆入原核表达载体pBV220中，经温度诱导和SDS-PAGE电泳证明外源蛋白表达。结果表明合成的E2蛋白cDNA经序列测定，与报道的SARS病毒相应序列一致，内切酶酶切及PCR均得到456bp的cDNA片段，与实验设计一致，证明此cDNA片段已插入pBV220载体中；SDS-PAGE电泳表明有外源蛋白表达。结论：用本文介绍的方法可成功地合成并克隆SARS病毒E2蛋自原核表达载体，此项研究结果为SARS的诊断和预防奠定了基础。     

艰难梭菌毒素C蛋白的克隆表达和抗体制备

目的克隆艰难梭菌毒素C(tcdC)基因并构建TcdC蛋白的原核表达载体,制备多克隆抗体。方法从艰难梭菌标准株(ATCC43255)基因组DNA中扩增获得tcdC基因的部分片段,连接到原核表达载体并转化到大肠杆菌中,诱导表达GST-TcdC/L和IL1-TcdC/L融合蛋白,前者用作免疫抗原,后者用作检测抗原。采用SDS-PAGE法鉴定融合蛋白的表达,并通过Ni柱纯化IL1-TcdC/L融合蛋白,Q柱纯化GST-TcdC/L融合蛋白。将纯化的GST-TcdC/L融合蛋白于兔背部皮内多点注射,每只1 mg,4周1次,共3次。最后1次免疫后2周,采血分离血清。用IL1-TcdC/L蛋白包被酶联板,采用ELISA法检测多抗血清效价;Western蛋白印迹法检测多抗特异性,结果 SDS-PAGE结果表明,所表达的2个融合蛋白与预期分子质量一致。ELISA结果显示,制备的TcdC多克隆抗体效价>1:6.4×10~4。Western蛋白印迹实验显示,制备的TcdC/L多克隆抗体能特异性识别艰难梭菌中的TcdC蛋白。结论成功克隆了艰难梭菌tcdC/L基因并进行了原核表达,成功制备了其多克隆抗体,为后续研究tcdC基因在艰难梭菌致病过程中的作用及机制奠定了基础。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

由转染的哺乳动物细胞系产生的2型登革病毒胞外亚病毒颗粒及对其作为亚单位疫苗的研究

本试验旨在建立一个能持续稳定地表达2型登革病毒胞外亚病毒颗粒 ( EP)的细胞系 ,并评估 EP在小鼠中的免疫原性。 EP是无核壳 ,但有前膜 ( pr M)、包膜 ( E)埋置于双脂层中的病毒颗粒。为此 ,作者首先构建了重组质粒 pc D2 EP,它编码 2型登革病毒新几内亚 C( NGC)株的 E蛋白和在 pr M/M裂解位点处有突变的 pr M蛋白 ,后者可抑制 E蛋白的融合活性 ,减少表达病毒蛋白对细胞的毒性作用。pr M/E的共表达有利于细胞稳定生产 EP。质粒 pc D2 EP转染 CHO- K1细胞后 ,经过四轮有限稀释克隆法筛选出了能高水平表达蛋白的转染细胞—— D…     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

人C型凝集素受体dectin-1单克隆抗体的制备

目的:克隆获得并原核表达人dectin-1基因的胞外段,以其作为抗原,制备人C型凝集素受体dectin-1的单克隆抗体.方法和结果:利用RT-PCR技术从人的外周血中克隆获得人dectin-1基因,克隆到pCDNA 3.0(+)载体中,获得pCDNA3.0(+)-dectin-1质粒.将dectin-1胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)载体,构建原核表达质粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp),转到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中,IPTG诱导目的片段原核表达,得到高效表达的dectin-1(202 bp-744 bp),镍柱亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,取抗体滴度高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,获得1 5株阳性杂交瘤细胞株,利用有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞株的筛选,获得5株单克隆细胞株.用单克隆细胞株制备小鼠腹水模型,经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得dectin-1的单克隆抗体.经蛋白质印迹法验证,此单克隆抗体能有效地识别人和小鼠的dectin-1蛋白.结论:成功制备获得dectin-1蛋白的特异、高效的单克隆抗体.     

TT病毒结构蛋白抗原在大肠杆菌中的表达及应用

目的　用原核系统表达TT病毒 (TTV)的重组蛋白抗原 ,建立诊断 (TTV)感染的特异性方法。方法　采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后将之嵌入到原核表达载体pQE30中 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为 90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了West ern -Blot分析 ,用间接ELISA方法检测血清抗 - (TTV)IgG抗体。结果　经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论　该蛋白具有良好的抗原活性 ,可以有效地用于TTV的感染检测中     

TT病毒结构蛋白抗原在大肠杆菌中的表达及应用

目的 用原核系统表达TT病毒（TTV）的重组蛋白抗原，建立诊断（TTV）感染的特异性方法。方法 采用PCR方法扩增TTVORF2基因，将之插入到测序质粒载体中进行测序，验证序列正确后将之嵌入到原核表达载体pQE30中，并转化大肠杆菌M15菌株，进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA柱层析纯化后，得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot分析，用间接ELISA方法检测血清抗－（TTV）IgG抗体。结果 经IPTG诱导后，筛选出2株高表达株。结论 该蛋白具有良好的抗原活性，可以有效地用于TTV的感染检测中。     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体,鉴定其特性,为进一步研制HIV治疗性抗体提供贮备。方法将HIV-1 gp120基因片段连接到经酶切的原核表达载体PEGX-4T-2中,利用大肠杆菌XL1-blue表达GST-HIV蛋白。表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆。重组免疫印迹分析(RIBA)和Western blot检测抗体特异性。结果构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1 gp120抗原基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE可见1条相对分子质量(Mr)32 000的表达蛋白条带。获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价为10-3,小鼠腹水效价为10-5,抗体亚型均为IgG1。RIBA结果显示6株单抗皆只与HIV-1 gp120抗原反应。Western blot结果显示在Mr32 000处可见1条单一目的条带。结论获得6株稳定分泌抗HIV-1 gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定了基础。     

表达JEV prM和E基因的高度减毒痘苗病毒MVA株免疫小鼠后对致死性JEV感染的防御作用

作者将韩国分离的乙型脑炎病毒（JEV）野毒株K94P05的糖基化膜前体（PrM）和包膜(E）蛋白的基因插入到高度减毒的宿主范围限定的痘苗病毒MVA株基因组内,获得两个重组病毒vJH6和vJH9,分别由合成的痘病毒启动子Psyn和修饰的痘苗病毒H5启动子控制。JEV野毒株K94P05的核苷酸序列与JEV原型中山株有88％相同,但是K94P05株的E基因内没有痘菌病毒早期终止信号。应用转移载体将目的JEV基因转移至MVA基因组内的缺失位点组成重组病毒并用JEV抗体免疫染色进行检测,结果表明两个重组体都稳定地表达prM和E蛋白。但vJH9的滴度较vJH6高3～5倍。vJH6和vJH9感染的CEF细胞与抗JEV K94P05株E蛋白表位的单克隆抗体NBl的免疫荧光反应强度与K94P05野毒株相似,而非重组MVA感染的细胞则未显示这种染色结果。用JEV多克隆抗体的结果与单克隆抗体相似。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

真菌免疫调节蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

目的通过在大肠杆菌中表达真菌免疫调节蛋白LZ-8,以制备高效价的抗体。方法将所克隆的LZ-8基因构建成原核表达载体pET-30a-lz8,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导其表达；原核表达产物经金属镍离子螯合柱纯化后,采用常规方法制备家兔多克隆抗体,并用间接ELISA法测定阳性血清的效价。结果大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE电泳检测到相对分子量约为14ku的目的蛋白；用考马斯亮兰法测定所表达的外源蛋白表达量为34．46mg/L；纯化后的目的蛋白免疫家兔后,经间接ELISA检测阳性血清的稀释比例达到了10~4,证明该蛋白具有良好的抗原性。结论真菌免疫调节蛋白LZ-8能够在大肠杆菌中获得高水平的表达,且获得了高效价的家兔多克隆抗体,为以后对该蛋白的功能研究打下了基础。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

EGFR/HER2联合多肽表位疫苗的构建及体液免疫学分析

构建以乙肝病毒核心抗原(HBcAg)为载体的带有1个EGFR和2个HER2的模拟B细胞表位多肽的融合表达质粒pET28a/HBcAg-△n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫BALB/c小鼠获得抗目的蛋白的抗体。采用PCR法将3个模拟表位插入HBc序列的第78～79位,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21(DE3)作宿主菌表达出融合蛋白HBHE,纯化后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。测序结果表明,重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。以HBcAg为载体的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与3个B表位结合的抗体,为进一步研究HER家族成员联合多肽表位疫苗的广谱抗肿瘤作用奠定了基础。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

诱生型一氧化氮合酶抗体的制备与初步应用

目的制备诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)特异性抗体并应用于iNOS检测。方法将iNOSN端片段装入原核表达载体pET 2 8a(+) ,在大肠杆菌BL2 1中表达 ,两步法纯化目的蛋白 ,使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。获得的抗血清用于小鼠巨噬细胞及小鼠脑缺血模型中iNOS的检测。结果得到具有较高表达量的融合蛋白 ,经两步纯化获得iNOSN端融合蛋白纯品 ,将此蛋白免疫家兔 ,得到iNOS多克隆抗体 ,Westernblot分析表明该抗体不与nNOS、eNOS交叉反应 ,而能检测组织、细胞中的iNOS。结论原核表达iNOSN端片段制备的iNOS抗体具有很好的反应性及特异性     

大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素β亚基编码DNA序列的克隆及表达

目的:构建PGEX-3X/大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素(hTSH)13DNA编码序列原核表达载体,并在E.coliDH5α中进行表达,用于GD(Graves diease)的实验研究.方法:用大肠杆菌偏嗜性密码子替换已知hTSHβ亚基基因编码序列中相应的密码子,按重新设计后的编码序列进行DNA化学合成,然后克隆入表达载体pGEX-3X并进行酶切电泳、测序鉴定,进而在E.coli DH 5α中进行诱导表达.对所表达的GST融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blotting及hTSH电化学发光免疫测定.结果:经鉴定,重组质粒pGEX-3X/hTSHβ含有与预期结果一致的435 bp编码hTSHβ链的DNA序列.表达产物为hTSHβ与GST融合蛋白.分子质量约42 ku,于SDS-PAGE中的相应部位可见深染的特异性蛋白条带,可被GST抗体识别并可被抗hTSH抗体检测.结论:实验成功建立了hTSHβ肽链的体外表达系统,为进一步制备hTSHAb及进行GD的研究奠定了基础.     

染性法氏囊病病毒分离株变异的研究

为了了解我国传染性法氏囊病病毒(IBDV)的变异现状,并为研究高效疫苗打下基础,用琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE和序列分析等分子生物学方法,分析IBDV病毒RNA,结构蛋白的变异情况。结果表明⑴3种不同源IBDV均由双节段RNA组成,大小基因片段的电泳迁移率各病毒间无差异;⑵不同源IBDV的结构蛋白带谱相同,但各蛋白带的百分含量有差异;⑶IBDV血清Ⅰ型不同亚型的JS3和JS4毒株主要保护性抗原VP2高变区核酸序列的同源性最高达98%,与已发表的vvIBDV,IBDV变异株,IBDV经典株及IBDV弱毒株核苷酸序列同源性在92%～98%之间。根据IBDV的大开放读框推导出该片段编码蛋白的氨基酸序列,JS3和JS4的同源性最高达97%,与上述其它毒株的同源性在91%～97%之间;七肽区的氨基酸序列,在强毒株完全相同,而在弱毒株有一个丝氨酸突变成其它氨基酸。