白蛋白纳米载体介导的反义核酸对肝癌细胞端粒酶活性的抑制

目的 利用纳米载体增强端粒酶反义寡核苷酸时肝脏肿瘤细胞端粒酶活性的抑制作用.方法 实验设6组:空白对照组、纯纳米粒组、游离正义寡核苷酸组、游离反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸-纳米粒组和反义寡核苷酸-纳米粒组.用TRAP-ELASA法检测端粒酶反义寡核苷酸对肿瘤细胞端粒酶活性的影响,以MTT法测定端粒酶反义寡核苷酸对肝脏肿瘤细胞(HepG2)生长的抑制作用.结果 ①纯纳米粒组、游离端粒酶正义核苷酸组和端粒酶正义核苷酸-白蛋白纳米粒处理组的端粒酶活性与空白对照组差异无显著性(P>0.05).②游离端粒酶反义核苷酸和端粒酶反义核苷酸-白蛋白纳米粒处理的肿瘤细胞的端粒酶活性与空白对照相比明显下降(P<0.05),且两者之间差异存在显著性(P<0.05).③纯纳米粒组、游离端粒酶正义核苷酸和端粒酶正义核苷酸-白蛋白纳米粒对肿瘤细胞的抑制作用很小.游离端粒酶反义核苷酸的抑制作用明显,端粒酶反义核苷酸-白蛋白纳米粒的抑制作用最强,两者之间差异有显著性(P<0.05).结论 白蛋白纳米粒可作为反义技术治疗的有效载体,增强端粒酶反义核苷酸的抑制作用.     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用和效果

目的:设计了针对VEGF的第Ⅲ外显子(exon,E3)的反义、错义和正义寡核苷酸,观察VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用.方法:免疫细胞化学法观察反义、正义、错义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VE GF表达的影响;观察制备反义、正义、错义寡核苷酸的条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果:VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF的表达有明显抑制作用.结论:反义VEGF寡核苷酸通过抑制C6胶质瘤细胞VEGF的表达,进而抑制内皮细胞的生长.     

进一步加强病毒性肝炎基因治疗的研究

0　引言病毒性肝炎是目前严重危害人类健康的最常见的世界性感染性疾病之一 ,迄今仍无有效抗病毒药物 .从遗传学观点看病毒性 (乙型 HBV和丙型 HCV)肝炎是获得性遗传病 ,因此 ,可通过阻断基因表达或抑制基因功能来治疗 .病毒性肝炎基因治疗是基因疗法研究领域的一个重要分支 ,在十余年的研究中 ,取得了许多可喜的成果 ,但也遇到了一些亟待解决的问题 .其治疗策略主要包括反义寡核苷酸、核酶 (ri-bozyme)和 DNA免疫 .1　反义寡核苷酸 ( AODNs)1990年 Goodarzi首先观察了 AODNs对 HBV基因表达的抑制作用 .随后 ,国内外学者选择 HBV…     

针对HBV X基因区三个关键位点的反义寡核苷酸体内抑瘤研究

目的：研究HBV X基因区关键区段的反义寡核苷酸（asON)对人肝癌裸小鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用。方法：PCR法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸及无关对照序列，进行硫代化修饰，以HBV DNA转染的H G2.2.15细胞接种裸小鼠，24h内同部位一次性用药100μg，观察并比较3种反义硫代寡核苷酸的体内抑瘤作用。ELISA法检测反义核酸作用裸小鼠血清中HBsAg和HBeAg含量的变化。结果：3种药物作用裸小鼠组均表现为出瘤潜伏期延长，出瘤率明显低于未用药瘤细胞对照组（P＜0．05），且瘤体生长缓慢。互补于Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸一次性给药方式对荷瘤鼠HBsAg和HBeAg的表达无明显抑制作用；无关序列不影响荷瘤鼠瘤体生长及HBV抗原表达。结论：针对HBV X基因区关键部位的反义寡核苷酸可抑制荷瘤裸小鼠人肝癌的生长，为HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。     

靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞生长的抑制作用

目的探讨反义c-myc寡核苷酸(ASODN)对半乳糖诱导的兔晶体上皮细胞(LEC)生长的影响.方法人工合成与c-myc基因第二外显子翻译起始区序列互补的寡核苷酸,用半乳糖和反义寡核苷酸处理培养的晶体上皮细胞,应用细胞计数法和MTT法观察反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞增殖的影响.结果 2.5～10.0 μmol/L反义c-myc寡核苷酸能抑制半乳糖诱导的晶体上皮细胞的增殖,10.0 μmol/L时作用较显著.结论反义c-myc寡核苷酸对半乳糖诱导的白内障晶体上皮细胞的生长增殖有抑制作用.     

反义寡核苷酸减弱转染p16基因对包装细胞生长的抑制

目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.     

Bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞株的生长抑制作用

目的：研究bcl-2反义寡核苷酸对肾细胞癌细胞的生长抑制作用及剂量一效应关系。方法：设计、合成与已知人类基因无同源性的bcl-2反义寡核苷酸(AS1翻译起始端，AS2编码区)，以阳离子脂质体Lipofectin转染不同的肾癌细胞株，MTS比色实验测定细胞活率。结果：单纯Lipofectin、反义寡核苷酸及正义寡核苷酸处理，对肾癌细胞ACHN生长无抑制作用，而转染入细胞内的反义寡核苷酸可抑制多种肾癌细胞的生长(ACHN、RCW和OSRC-2)，且抑制作用与剂量呈正相关。结论：bcl-2反义寡核苷酸可剂量依赖性抑制多种肾癌细胞的生长。     

反义寡核苷酸对K_(562)细胞增殖的作用

反义寡核苷酸可以特异地抑制基因表达 ,设计应用与 bcr-abl融合基因m RNA互补的反义寡核苷酸作用于 K562 细胞 ,结果显示 :反义寡核苷酸对 K562 细胞的生长有明显的抑制作用 ,硫代化与未修饰反义寡核苷酸相比有明显的稳定性 ;反义寡核苷酸与VP16联合应用 ,可明显提高对 K562 细胞的增殖抑制作用。反义寡核苷酸的应用将为慢性粒细胞白血病患者自体骨髓移植体外净化提供新的途径     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

硫代反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）C基因翻译起始区和C基因区硫代反义寡聚脱氧核苷酸（ASON）对HBV表达的序列性抑制作用。方法 以2．2．15细胞系作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区（C区）15聚硫代ASON,通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2．2．15细胞中,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)含量。结果 与HBV mRNA C基因起始区互补的硫代ASON序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡聚脱氧核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性。另外,硫代ASON对细胞生长无毒性作用。结论 硫代ASON能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达。     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。     

HepG2.2.15细胞的差异性表达及对IFN-α的反应性研究

采用有限稀释法从HepG2.2.15细胞株中分离出10株单克隆细胞株.ELISA法检测其HBsAg与HBeAg表达量,根据HBsAg、HBeAg表达量的不同,筛选出最高、中等、最低3株克隆细胞株.MTT法进行干扰素(IFN)-α的细胞毒作用研究,表明IFN-α对不同克隆细胞株药物毒作用相似.ELISA法检测各克隆细胞株给IFN-α前后HBsAg、HBeAg表达量,IFN-α对HepG2.2.15细胞HBeAg的抑制作用较弱,对HBsAg、HBV DNA的抑制作用较强,且对表达量高的克隆细胞株抑制作用更强.不同HepG2.2.15细胞表达HBsAg与HBeAg存在差异性,且表达量高的细胞株对治疗浓度的IFN-α更加敏感.     

三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究

目的 研究三叶青4个提取部位对乙肝病毒的抑制作用.方法 运用mT法检测样品药物导致50%细胞死亡的数值浓度为CC50;用ELISA方法检测样品药物达到抑制HbsAg、HbeAg分泌,以及运用荧光定量PCR法检测样品药物抑制病毒DNA复制量的50%时的浓度数值为IC50.结果 三叶青4个提取部位对乙肝病毒分泌的HbsAg、HbeAg均有抑制作用.结论 三叶青乙酸乙酯部位对乙肝病毒具有较强活性,能明显降低HBV的DNA复制水平,可进一步从中提取分离具有更强生物活性的物质,为新药开发提供物质基础.     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)s基因和c基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme)对HBV表面抗原(HB—sAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制效应。方法：设计合成针对HBVs基因ORF A^157UG、e基因ORF A^1816UG的DNAzyme DrzBS、DrzBC，在2.2．15细胞上观察其对HBVs基因、c基因的表达抑制效应。结果：DrzBS、DrzBC作用于2．2．15细胞后，可显著抑制HBVs基因、c基因的表达，有效浓度为0．1—2．5μmol／L并呈剂量依赖性，最高抑制率分别为94．2％和91．8％；有效抑制持续时间可达72h，DrzBS、DrzBC在细胞内对HbeAg、HbeAg表达的抑制效率，明显高于作为对照的反义寡核苷酸AsBS、AsBC，有效浓度较后者低至少l0倍。其对2．2．15细胞的HBVDNA复制无明显影响，亦未见明显的细胞毒性作用。结论：在2．2．15HBV细胞模型系统，DrzBS、DrzBC能高效阻断HBVs基因、e基因的表达，是一种特异性的、高效的抗HBV基因治疗剂。     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.