抗肿瘤反义寡核苷酸药物靶标的研究进展

肿瘤是一种多基因相关疾病,反义寡核苷酸药物可以特异性地与靶基因mRNA互补结合,封闭靶基因的表达,在肿瘤的基因治疗中独树一帜。现已发现许多基因在调节细胞增殖和衰老、细胞凋亡、细胞周期、血管生成及信号转导等方面起着重要作用,并证实它们在抗肿瘤反义治疗中可以作为有效的分子靶标。本文综述了近年来发现的抗肿瘤反义寡核苷酸的治疗靶点,并提出了多靶点反义寡核苷酸联合应用治疗肿瘤的新观念。     

抗乙酰胆碱酯酶基因表达的反义寡核苷酸的研究进展

反义核酸技术是近年来迅速发展的选择性抑制特定基因表达的一种生物技术,乙酰胆碱酯酶抑制剂可用于治疗早老性痴呆和重症肌无力等疾病,本文综述了利用反义寡核苷酸抑制乙酰胆碱酯酶的表达研制新型胆碱酯酶抑制剂的研究进展.     

反义寡核苷酸的抗病毒效果

寡核苷酸因其所具有的精巧特异性，已被推荐用作包括癌症，微生物感染和自身免疫病在蛤内的多人类疾病的治疗制剂，目前约有１６个临床试验正在实验，本文从下述三方面评述了反义寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的抗病毒效果，（１）序列特异性抗病毒效果；（２）非序列特异性抗病毒效果，（３）序列特异性反义非依赖性效果。     

反义寡核苷酸技术研究进展

反义寡核酸技术，是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基配对与细胞内核酸（DNA或RNA）特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术，是一种新的药物开发方法。其机制是：①反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子，可以激活RNase H。该酶可以切割杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。②不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译：另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。     

反义寡核苷酸靶向肝细胞体外抗乙型肝炎病毒的实验研究

作者在对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒基因测序的基础上，设计合成了１段针对Ｕ５样序列区的１６－聚硫代磷酸反义寡核苷酸，并将其与直导向性载体－半乳糖化白蛋白和半乳糖化多聚赖氨酸连接，在２．２．１５细胞中观察了它们的抗病毒作用。     

整合素β3反义寡核苷酸抗小鼠妊娠的作用

目的：探讨整合素β3反义寡核苷酸(ASODN)活体转染假孕小鼠子宫内膜抗早孕的可能性。方法：将整合素β3反义寡核苷酸注入假孕1d小鼠子宫,同时同侧输卵管植入2细胞期受精卯10枚,小鼠正常饲养,5d天取小鼠子宫内膜进行Western Blotting检测整合素β3蛋白表达情况;19d进行小鼠子代出生率评估。结果：①Western Blotting检测5d天小鼠子宫内膜整合索艮蛋白强表达,10pmol整合素β3反义寡核苷酸转染假孕小鼠子宫内膜后5d天小鼠子宫内膜整合素β3蛋白减弱表达,100pmol整合素β3反义寡核苷酸转染时弱表达,单纯脂质体轻度影响其表达;②19d进行小鼠子代出生率评估,受孕鼠转染整合素β3反义寡核苷酸后子代小鼠出生抑制率为85％。结论：整合素陆反义寡核苷酸可能整合到假孕小鼠子宫内膜抑制其蛋白表达,阻止胚胎着床。由于例数较少,其整合素β3反义寡核苷酸后抑制子代小鼠出生率需进一步研究。     

整合素β3反义寡核苷酸抗小鼠妊娠的作用

目的探讨整合素β3反义寡核苷酸(ASODN)活体转染假孕小鼠子宫内膜抗早孕的可能性。方法将整合素β3反义寡核苷酸注入假孕1d小鼠子宫,同时同侧输卵管植入2细胞期受精卵10枚,小鼠正常饲养,5d天取小鼠子宫内膜进行Western Blotting检测整合素β3蛋白表达情况;19d进行小鼠子代出生率评估。结果Western blotting检测5d小鼠子宫内膜整合素β3蛋白强表达,10pmol整合素岛反义寡核苷酸转染假孕小鼠子宫内膜后5d小鼠子宫内膜整合素β3蛋白减弱表达,100pmol整合素β3反义寡核苷酸转染时弱表达,单纯脂质体轻度影响其表达;19d进行小鼠子代出生率评估,受孕鼠转染整合素β3反义寡核苷酸后子代小鼠出生抑制率为85％。结论整合素β3反义寡核苷酸可能整合到假孕小鼠子宫内膜抑制其蛋白表达,阻止胚胎着床。由于例数较少,其整合素β3反义寡核苷酸后抑制子代小鼠出生率需进一步研究。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

乙型肝炎病毒转基因小鼠体内肝靶向反义RNA抗病毒疗效研究

目的：探讨半乳糖修饰的反义RNA真核表达质粒在乙型肝炎病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。方法：以半乳糖多聚赖氨酸（Gal-PLL)作肝靶向载体，将乙型肝炎病毒基因C区的反义RNA真核表达重组质粒（pCEP4-aC）制备为Gal-PLL－pCEP4-aC。将24只血清HBV DNA、HBsAg阳性的小鼠，随机等分为Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组、Gal-PLL-pCEP4对照组和生理盐水阴性对照组，于实验第1天尾静脉分别注射Gal-PLL－pCEP4-aC、Gal-PLL－pCEP4（100μg/只）和等体积的生理盐水，观察治疗前后血清HBV DNA以及HBsAg变化。结果：Gal-PLL－pCEP4-aC治疗组21天时血清HBV－DNA转阴率62．5％（5／8），且7，14，21天时血清HBsAg明显降低；而Gal-PLL－pCEP4组血清HBV DNA转阴1只（1／8），生理盐水组8只均未转阴，两组用药后血清中HBsAg与用药前比较差异性均不明显（P＞0．05）。结论：肝靶向反义RNA能在乙肝基因小鼠体内抑制HBV的复制和抗原表达。     

拉米夫定治疗中HBV多聚酶M204V/M204I和L180M变异的检测及意义

目的：建立以PCR—RFLP检测HBV多聚酶M204V／M2041和L180M变异的方法,探寻上述位点变异之间的关系。方法：构建质粒pUCm—V M／I L,采用基因序列测定技术以确证PCR—RFLP检测HBV多聚酶M204V／M204I和L180M变异的方法。采用建立的方法对拉米夫定治疗过程中发生耐药变异的41例慢性HBV感染患者进行YMDD变异类型的检测。结果：①建立了检测HBV多聚酶M204V／M204I和L180M变异的PCR—RFLP方法,且与基因序列测定的结果一致;②HBV多聚酶M204V变异,占YMDD变异的31．7％(13／41),均伴有L180M变异;M204I变异占YMDD变异的68．3％(28／41),其中46．4％(13／28)伴有L180M变异。结论：①HBV多聚酶M204V／M2041和L180M变异的PCR—RFLP检测方法可靠;②M204V变异均伴有L180M变异,46．4％的M204I变异也伴有L180M变异。     

HBVe抗原抗体系统与丁型肝炎病毒感染的关系研究

探讨ＨＢＶｅ抗原抗体系统与丁型肝炎病毒感染的关系。方法将６６７例乙肼表面抗原阳性患者分成ｅ抗原阳性、抗－ＨＢｅ阳性和两者均阴性等三级进行丁型肝炎病毒标志物的检测和分析。结果６６７例乙肝患者ＨＤＶ感染４３例（６．４％）,其中ＨＢｅＡｇ阳性组为５．３％（１１／２０６）。抗－ＨＢｅ阳性组为１０．９％（２６／２３７）,ｅ抗原抗体 性组ＨＤＶ为２．３％（６／２２５）。抗ＨＢｅ性组ＨＤＶ感染明显升高（Ｐ〈０．     

乙,丙型肝炎病毒重叠感染临床研究

目的 了解徐州地区慢性乙型肝炎（ＣＨＢ）患者中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）、丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）重叠感染情况。方法 对徐州地区２４７例慢性乙型肝炎患者（ＣＨＢ）进行血清丙型肝炎抗体（抗－ＨＣＶ）及丙型肝炎病毒（ＨＢＶ、ＨＣＶ）重叠感染与单纯ＨＢＶ感染患者的临床资料进行比较。结果 （１）徐州地区ＨＢＶ、ＨＣＶ重叠感染率为１２．９６％（３２／２４７）。（２）重叠感染者的年龄、血清丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）     

山西省地区乙型肝炎病毒基因分型及临床意义

目的了解山西省地区乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布特征,探讨HBV各基因型与血清HBV-DNA水平的关系以及各基因型与疾病的进展和转归的临床意义。方法法随机收集山西省HBV阳性病例128例,包括慢性乙型肝炎78例,肝硬化34例,急性肝炎8例,重型肝炎患者8例。取其外周静脉血,采用型特异性引物巢式PCR方法对血清中的HBV进行基因分型,并结合临床资料进行统计学分析结果山西省地区乙型肝炎患者HBV基因分型存在B型、B＋C混合型和C型,以C型和B＋C型为主;基因型C型的HBV-DNA载量的均值水平为2×108,显著高于其他型（p〈0.05）;C型HBeAg阳性率较B型和B＋C型高（p〈0.05）;混合型及C基因型与较严重的肝脏疾病有关,更易发生重症肝炎、肝硬化。结论山西省地区基因型以C型和B＋C型为主;基因型C的HBV-DNA载量水平均值显著高于其他型;混合型及C型与较严重的肝脏疾病有关。     

乙肝病毒DNA和前S1抗原及其标记物三者相关性分析

目的探讨乙肝病毒前S1抗原(PreS1)与乙肝病毒DNA(HBV DNA)、乙肝病毒标志物(HBVM)之间的相关性,为拉米夫定(Lamivudine)治疗提供新的监测指标。方法收集慢性乙型病毒性肝炎患者500例,其中HBV DNA阳性400例(拷贝数>500/ml),按HBV-DNA含量由低到高分8组;其余为HBVDNA阴性对照100例。同步以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测PreS1;以电化学免疫发光法检测乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗体(HBeAb)、乙肝病毒表面抗原(HBsAg);以荧光定量PCR法检测HBV DNA(以HBV DNA拷贝数>500/ml为阳性)。结果(1)在HBVDNA拷贝数500~1×106/ml之间,PreS1的阳性率比HBeAg高(P<0.05);在HBV DNA拷贝数1×106/ml以上,二者阳性率无显著性差异(P>0.05);(2)PreS1的灵敏度为90%(360/400),高于HBeAg的68.5%(274/400)(P<0.05);PreS1的阴性预示值为55.6%(50/90),高于HBeAg的43.2%(96/222)(P<0.05);PreS1的检测有效率为82.0%(410/500),高于HBeAg的64.8%(324/500)(P<0.05)。(3)在HBVDNA拷贝数500~1×104/ml之间,HBsAg的阳性率比PreS1高(P<0.05),在HBVDNA拷贝数1×104/ml以上,HBsAg的阳性率与PreS1的阳性率无显著性差异(P>0.05)。在HBVDNA拷贝数500~1×106/ml之间,HBeAb有较高的阳性率。结论PreS1与HBVDNA具有较好的相关性,其检测灵敏度和阴性预示值、检测有效率都优于HBeAg检测。PreS1可作为拉米夫定等抗病毒药物疗效观察指标之一。HBeAg阴性、HBeAb阳性不是传染性消失的可靠指标。     

针对HBV X基因区三个关键位点的反义寡核苷酸体内抑瘤研究

目的：研究HBV X基因区关键区段的反义寡核苷酸（asON)对人肝癌裸小鼠模型的抑瘤生长及体内抗HBV作用。方法：PCR法分别合成了互补于HBV X基因的翻译起始区Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸及无关对照序列，进行硫代化修饰，以HBV DNA转染的H G2.2.15细胞接种裸小鼠，24h内同部位一次性用药100μg，观察并比较3种反义硫代寡核苷酸的体内抑瘤作用。ELISA法检测反义核酸作用裸小鼠血清中HBsAg和HBeAg含量的变化。结果：3种药物作用裸小鼠组均表现为出瘤潜伏期延长，出瘤率明显低于未用药瘤细胞对照组（P＜0．05），且瘤体生长缓慢。互补于Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸一次性给药方式对荷瘤鼠HBsAg和HBeAg的表达无明显抑制作用；无关序列不影响荷瘤鼠瘤体生长及HBV抗原表达。结论：针对HBV X基因区关键部位的反义寡核苷酸可抑制荷瘤裸小鼠人肝癌的生长，为HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。     

淋巴瘤化疗导致的乙型肝炎病毒再激活及其预防

淋巴瘤化疗相关乙型肝炎病毒(HBV)再激活的发生率及病死率均有逐年上升趋势,因此预防化疗所致的HBV再激活尤为重要。发生HBV再激活的危险性与HBV的感染、抗肿瘤药物的应用等有关。对于合并HBV慢性感染的淋巴瘤患者,化疗前应施行预防性抗病毒治疗,从而避免HBV再激活,以完成多疗程化疗,延长生命,提高生活质量。化疗前预防性抗HBV治疗得到普遍认同,本文就这一领域的研究予以综述。