外源基因在大肠杆菌高效表达的技术进展

利用基因工程,可将外源基因导入大肠杆菌或其它工程细胞,使其作为生物工厂生产人类需要的蛋白质。在利用大肠杆菌表达外源基因时,必须考虑表达的基因载体、外源基因的性质、原核细胞启动子、读码框架及宿主菌调控系统这5个基本条件。本文结合笔者工作,介绍提高外源基因在大肠杆菌表达效率的一些技术进展。为提高外源基因转录水平,可选择合适的启动子、改进宿主菌调控系统和引入转录终止区。在提高外源基因转译水平方面,需改善核糖体结合点结构,考虑密码子使用的问题和增加mRNA稳定性。为提高外源蛋白的稳定性,可选择蛋白酶缺陷的宿主菌、注意蛋白质N端规律,或利用外泌型表达基因载体。     

大肠杆菌外源基因表达产物的下游技术

以大肠杆菌作为工程菌的外源基因产物常以包涵体形式存在，这使得这类基因工程下游工艺具有不同于其它蛋白质纯化的特点。下游工艺包括包涵体提取，重组蛋白变性、复性、纯性、活性检测等复杂技术环节。本文主要对活性检测之外的各技术环节要点进行综述。     

基因工程的下游技术

基因工程的下游技术是现代生物技术的关键技术，它的重要性已越来越为人们所重视。生物技术产品的下游处理技术包括基因工程产物的分离、纯化及分析鉴定。本综述了基因工程产物的分离、纯化及鉴定的具体方法及鉴定标准。     

大肠杆菌中TIR二级结构与基因表达的关系

影响外源基因在大肠杆菌中表达的一个因素是翻译起始区(TIR)的二级结构。降低TIR二级结构的稳定性,可以直接提高翻译起始效率,或者间接增高mRNA的稳定性,克服转录极性效应,从而提高外源基因在大肠杆菌中的表达。     

基因工程的下游技术

基因工程的下游技术是现代生物技术的关键技术 ,它的重要性已越来越为人们所重视。生物技术产品的下游处理技术包括基因工程产物的分离、纯化及分析鉴定。本文综述了基因工程产物的分离、纯化及鉴定的具体方法及鉴定标准     

dinB基因表达对大肠杆菌的作用

dinB基因编码的Pol Ⅳ是一种错误趋向性（error-prone）DNA聚合酶。利用超表达（overexpression）方法对dinB基因的生物学意义进行了初步的探索。     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

人重组巨噬细胞移动抑制因子在大肠杆菌的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ技术，从人Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增巨噬细胞移动抑制因子的ｃＤＮＡ经与大肠杆菌表达载体重组，构建成不同表达克隆，在大肠杆菌高效表达成功ＭＩＦ融合蛋白，占细菌总蛋白的３２％－６０％，经纯化的ＭＩＦ产物纯度可达９８％，其氨基酸组成分析与理论值一致。     

直接法将质粒从酵母电转化至大肠杆菌

随着人类基因组计划的完成,蛋白质的功能研究将成为后基因组时代的主要任务１。任何蛋白质功能的发挥,离不开与其他蛋白质之间的相互作用。随着分子生物学方法的发展,出现了以基因文库为基础的蛋白探测、噬菌体呈现等技术,但这些方法反映的都只是蛋白的体外相互作用。酵母双杂交系统是一种新的直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的新方法,灵敏度高２３。双杂交系统是基于一些转录激活因子（如酵母的Ｇａｌ４蛋白和细菌的ＬｅｘＡ蛋白）,往往由两个在结构上可以分开、功能上相互独立的结构域构成,这两个结构域在同一细胞内只…     

大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中克隆了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶约０．８ｋｂ的编码基因，序列测定表明其序列与已发表资料一致，将此０．８ｋｂ的甲硫氨酸氨肽酶的编码基因克隆到原核高效表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌后进行表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明表达产物分子量为３２０００，表达量约占菌体蛋白的２０％左右，活性测定表明其活性中达２０Ｕ／ｍｌ菌液。     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

人白细胞介素6在大肠杆菌中的高效表达

应用PCR和重组DNA技术,结合人工合成寡核苷酸引物,成功地构建成人白细胞介素6高效表达克隆,命名为pBMhIL6,使人rIL-6编码基因受控于P_RP_L串联启动子和人工合成SD序列,且以TAA终止密码子代替原人IL-6的TAG,在E.coli中获得人rIL-6的高效表达。SDS-PAGE和凝胶密度扫描分析证明表达的人rIL-6蛋白占E.coli总菌体蛋白的28%,分子量为21KDa,Western Blot证明其能特异地与抗IL-6 McAb结合。人rIL-6诱导表达动力学研究表明在42℃条件下诱导6小时,表达达峰值。不同菌株表达人rIL-6及其生长状态影响研究提示以E.coli DH5a生长菌密度至0.7时,人rIL-6诱导表达产率较高。以7TD1细胞株~3HTdR法测定表达的人rIL-6的HPGF活性为5×10~6u/L菌液。     

EBV编码产物与免疫逃避

EBV与人类包括肿瘤在内的许多疾病的发生、发展关系密切，其中EBV编码产物扮演着重要角色。这些在遮避免疫监控的进化中发展起来的病毒产物广泛参与正常细胞的各种生物学功能。本文试阐述了EBV编码产物的免疫遮避机制。     

人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

nNOS片段在大肠杆菌中的表达及特异性抗体的制备

目的：为了制备ｎＮＯＳ特异性抗体。方法：用ＰＣＲ的方法克隆出ｎＮＯＳ７０８￣８８１ａａ片段的编码基因并将之插入ｐＥＴ２８ａ原核表达载体。成果：成功地在大肠杆菌中获得高效表达。经ＨｉｓＴａｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和电泳回收法得到纯蛋白,将此蛋白免疫兔,制备出ｎＮＯＳ特异性抗体,抗体效价可达：８０００。利用该抗体成功地检测了正常肌肉和ＤＭＤ肌肉中ｎＮＯＳ的含量变化,证实ＤＭＤ肌肉中ｎＮＯＳ的含量明显低于