腺病毒载体介导的人肺囊性纤维化基因治疗的研究进展与展望

人类腺病毒（Ａｄ）基因治疗载体最杰出的应用是，通过气管内滴注将人肺囊性纤维化（ＣＦ）穿膜传导调节因子（ＣＦＴＲ）基因转入棉鼠气管上皮，并至少表达６周。综述了Ａｄ载体介导的ＣＦ基因治疗的研究进展，并主要从安全性和有效性两方面，论述了包含正常ＣＦＴＲｃＤＮＡ的复制缺陷型Ａｄ载体（Ａｄ－ＣＦＴＲ）介导的ＣＦ临床基因治疗要求与进一步研究策略。ＣＦ基因治疗的人体安全性试验已在美国批准实施，不久将进行有效性试     

通用型腺病毒伴随病毒载体的构建

目的构建含腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）基因组两端的反向重复序列（ＩＴＲｓ）和表达必须元件如启动子、多克隆位点和ＰｏｌｙＡ信号的通用型载体质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ，并获得重组ＡＡＶ（ｒＶＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ）。方法通过ＤＮＡ重组技术，将ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ、Ｎｅｏ基因、ＣＭＶ－ＩＥ启动子和多克隆位点组成表达盒子，取代含ＡＡＶ全基因组质粒ｐＳＳＶ９中ＡＡＶ结构基因部分，构建成质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ。用ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，能获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ。提取ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ感染细胞的染色体，用Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析重组病毒基因组在感染细胞中的存在情况。结果质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染包装细胞系后所得ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ滴度为４．２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，并且ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ能在转导细胞内实现其基因组与细胞染色体的整合。结论成功地构建了通用型ＡＡＶ载体，为今后的ＡＡＶ载体研究、基因治疗和临床应用打下了基础     

腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体与基因治疗

近年来,腺病毒载体(AV),腺病毒相关病毒载体(AAV)已经成为继反转录病毒载体(RV)以来最重要的病毒载体。与反转录病毒载体相比较,AV有其独特的优点,构建带有目的基因的腺病毒载体通过293辅助细胞产生重组腺病毒颗粒,用于活体基因转移及靶细胞感染。目前已利用AV研究了neo,lacZ,HBsAg及CFTR等基因在不用组织中的表达,其中人们已利用CFTR基因通过AV介导对囊性纤维化进行基因治疗临床试验。AAV最大的优点是能够将外源基因特异性整合在人19号染色体上,AAV与RV有许多相似之处。目前人们已经利用AAV研究了neo,DHFR,β-球蛋白,IL-2基因的表达情况。     

腺病毒伴随病毒载体介导的Ⅰ型单纯疱前病毒胸苷 …

目的 研究腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）载体介导杀肿瘤瘤基因的转移及其在肿瘤治疗方面的应用。方法 应用作者构建的腺病毒伴随病毒载体，克隆Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＩ－ＴＫ）基因，构建质粒ｐＡＣＴＫ－１９。用ｐＡＣＴＫ－１９转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＴＫ。再用此重组病毒感染肺癌细胞系Ａ５４９，并联合现氧鸟苷（ＧＣＶ）作用，研究其体外对肺     

端粒酶反义腺病毒载体对乳腺癌细胞MCF-7端粒酶的抑制作用

端粒酶ＲＮＡ的反义地人乳腺癌细胞系ＭＣＦ－７细胞端粒酶活性的影响。方法用重组腺病毒转移并表达端粒酶ＲＮＡ的反义ｃＤＮＡ,采用基因重组腺脂质体共转当闰酶反义重组病毒,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定病毒的整合功能,用ＴＲＡＰ－ 染法检测端粒酶活性。结果ＭＣＦ－７细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。对对照组ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７、ｖＡｄ－ＡＡＶ细胞相比,反义病毒感染后的细胞是恶性乳腺癌的典型细胞系。与对照组ＭＣＦ     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因 …

目的 构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β－半乳糖苷酶基因。方法 从人二倍体细胞的Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８．８－８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β－半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲＩ酶切Ａｄ     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。结论Ａｄ７ｖ载体的构建并成功表达外源基因为开发和应用这一载体打下了重要的基础     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

小鼠淋巴细胞趋化因子重组腺病毒载体的构建及其在骨髓树突状细胞中的表达

经ＲＴ－ＰＣＲ克隆小鼠淋巴细胞趋化因子（Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ，Ｌｔｎ）的全长编码ｃＤＮＡ，将其置于ＣＭＶ启动子下游，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ。Ｌｔｎ重组腺病毒载体ｐＡｘ１ｃｗ．ＣＩｍＬｔｎ与经ＥｃｏＴ２２Ｉ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞，制备Ｌｔｎ重组腺病毒，扩增到的病毒滴度为３．６×１０９ｐｆｕ／ｍｌ。用重组ＧＭ－ＣＳＦ从小鼠骨髓中扩增到的树突状细胞本身并不表达Ｌｔｎ；体外感染Ｌｔｎ重组腺病毒后４ｈ即可经ＲＴ－ＰＣＲ检测到Ｌｔｎ的表达，其２４ｈ的细胞培养上清体外对ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＣＤ８＋细胞具有显著的趋化活性，表明所制备的Ｌｔｎ重组腺病毒能有效介导Ｌｔｎ在树突状细胞中的表达，为研究Ｌｔｎ基因修饰的树突状细胞诱导Ｔ细胞免疫应答奠定基础。     

带有CMV,CEA启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性

ＴＫ基因－ＧＣＶ系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一。为了提高基因靶向表达的效率，使之可以应用体内实验，我们构建重组腺病毒ＡｄＣＭＶＴＫ和带有ＣＭＶ、ＣＥＡ两个启动子的ＡｄＣＭＶＣＥＡＴＫ，在五种癌细胞中进行了体外实验。发现腺病毒介导的ＴＫ基因赋予癌细胞ＧＣＶ敏感性比对照组高２￣３个数理级，并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为１：１０时仍产生较强的“旁观效应”。实验表明ＰＧ肺癌，ＣＡＥ结     

一种N端缺失的rhGM-CSF(7～127)在大肠杆菌中的表达与调控

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端均缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明三种载体表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的水平分别为２１％，１８．８％和２５％。经过用ＰＣｇｅｎｅ软件和Ｚｕｌｃｅｒ算法分析ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）－３′ＵＴＲｍＲＮＡ的二级结构，表明３′ＵＴＲ在终止密码ＴＧＡ附近形成两个茎－环结构，它可能与ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ载体高表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）有关。表达产物ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）经弱阴离子ＤＥＡＥ交换层析纯化后，纯度达到９２％，比活性为８×１０７Ｕ／ｍｇ。     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

大鼠颈动脉气囊损伤后腺病毒载体介导的在体基因转录

０６３大鼠颈动脉气囊损伤后腺病毒载体介导的在体基因转录［英］／ＬｅｅＳＷ…／／ＣｉｒＲｅｓ，一Ｒｅｓ。一１９９３，７３（５）．一７９７～８０７首先构建一个表达以细胞核为靶位的β－半乳糖苷酶的重组腺病毒载体（ＡＶ１ＬａｃＺ４），然后将其注入到大鼠气囊损...     

4型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法从４型腺病毒疫苗株（Ａｄ４）感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多步亚克隆构建成功缺失７８．９－８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４ＢｃｌⅠ大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色蚀斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果所构建的载体能稳定地表达β－半乳糖苷酶基因。结论４型腺病毒疫苗株载体的构建为利用该病毒做为基因工程疫苗载体打下了基础。     

逆转录病毒载体介导人GM－CSF基因转染肿瘤细胞

应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）介导人ＧＭ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞获得表达。经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将含有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组逆转录病毒载体ｐＺＩＰ－ＧＭ转染兼性病毒包装细胞系ＰＡ３１７，继之用病毒收获液感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１和人胃癌ＢＧＣ－８２３，经ＧＭ－ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ１测活和双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ测定表明：人ＧＭ－ＣＳＦ基因在人肿瘤细胞中获得稳定高效表达。为进─步建立ＧＭ－ＣＳＦ的转基因治疗模型提供了基础。     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

腺病毒、合胞病毒对外周血单个核细胞的IL-2受体表达及TNFα产生的影响

近年来国内外均注意到细胞因子及受体与病毒感染的关系。作者用１００ＴＣＩＤ５０的７型腺病毒（ＡＤＶ）及呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｌｏｎｇ株刺激正常人体外培养的外周血淋巴细胞（ＰＢＭＣ），ＡＰＡＡＰ法检测淋巴细胞ＩＬ－２受体阳性率，酶联免疫法检测淋巴细胞上清液的ＴＮＦａ。初步观察了ＡＤＶ、ＲＳＶ对人ＰＢＭＣ的ＩＬ－２受体表达、ＴＮＦα产生的影响。经２００Ｕｇ／ｍｌ的ＰＨＡ活化的ＰＢＭＣ加入ＡＤＶ、ＲＳＶ后对照组ＩＬ－２＋细胞百分率为３４．３％，ＡＤＶ组为１７．３％，ＲＳＶ组为１７％，较对照组均显著降低…     

H—2K^b基因导入小鼠造血细胞的研究

本研究应用分子克隆技术，用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）将ＭＨＣ－Ｉ类基因（即小鼠Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因）导入包装细胞ＰＡ３１７。用培养的病毒上清进一步感染ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的造血细胞，且形成了抗Ｇ４１８的ＣＦＵ－ＧＭ。通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ）和反转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），表明病毒上清感染后小鼠造血细胞及其形成的ＣＦＵ－ＧＭ中均整合了ＭＨＣ－Ｉ类基因，且已转录为ｍＲＮＡ，流式细胞仪（ＦＡＣＳ     

乙型肝炎病毒表面抗原S基因在人5型重组腺病毒中…

从美国Ｗｙｅｔｈ公司引进ｐＡｄ５△Ｅ３载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因（ＨＢＶＳ）ＰｒｅＳ２＋Ｓ，腺病毒晚期表达盒＋ＨＢＶＳ基因插入Ｅ３区，与ＥｃｏＲＩ消化的Ａｄ５ＤＮＡＡ片段共转染细胞获得重组腺病毒，相应命名为ｒＡｄ５Ｓ，ｒＡｄ５ＭＳ，ｒＡｄ５Ｓ２Ｓ。对所获得的重组病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）分析，证实重组病毒中含有目的基因，用ＥＬＩＳＡ分析ｒＡｄ５ＭＳ的表达量，其病变细胞和上清液滴度均为１：     

腺病毒载体介导的人类B7.1基因修饰的肿瘤细胞疫苗

为了证明腺病毒载体可做为将Ｂ７基因导入肿瘤细胞的替代载体，达到提高肿瘤细胞疫苗效应的目的，且不存在逆转录病毒载体的局限性，用同源重组的方法构建了表达人类Ｂ７．１ｃＤＮＡ的重组人类５型腺病毒，并用它感小鼠乳腺癌细胞系ＥＭＦ６和大鼠神经胶质细胞系Ｃ６检测Ｂ７．１基因在感染过的肿瘤细胞中的表达，用ＡｄＢ７．１感染守的肿瘤给同基因宿主接种，观察２它们在体内的致瘤性及对肿瘤的防治作用；用＾５１Ｃｒ释放法对用