基因重组人血红蛋白的纯化

目的 :探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法 :将α、β珠蛋白串联基因克隆进 pBV2 2 0表达载体 ,获得了高效表达 ,表达产物达细菌总蛋白的 2 0 %左右。该表达产物以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤后 ,用 8mol/L尿素溶解 ,先用Q SepharoseFastFlow阴离子交换纯化后 ,又经Sephacryl 10 0凝胶过滤纯化。 结果 :经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达 90 %左右。纯化产物经复性 ,具有与氧结合的能力。结论 :成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法     

突变型(α99,β82位Lys-Cys)人重组血红蛋白的纯化

将基因突变型（α９９,β８２位Ｌｙｓ－Ｃｙｓ）血红蛋白在ｐＢＶ２２０载体中诱导表达,表达产物达细菌总蛋白的２０％左右。该表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,先用Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换纯化,再经Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ－１００凝胶过滤纯化。纯化产物经复性,具有与氧结合的能力。     

大肠杆菌表达的重组人肿瘤坏死因子的分离纯化

对表达在大肠杆菌里的重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ－α）进行分离纯化。方法：采用疏水相互作用层析和离子交换层析。结果：考察了影响疏水相互作用层析纯化的因素,优化了层析操作条件;样品经疏水相互作用层析后,少量残余的杂蛋白可通过离子交换层析除去。结论：获得了比活性为 ２． ８９×１０~７ｕ／ｍｇ的 ｒｈＴＮＦ－α,总回收率为４０．６％。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.     

尿激酶原的纯化

尿激酶原是一种新型的溶栓药物,主要激活纤维蛋白表面的纤溶酶原,选择性地溶解血栓。临床实验证明：尿激酶原是一种有效的、副作用小的纤维蛋白特异性溶栓药物。文章综述了尿激酶原的性质、纯化方法及其产品中热原质的去除。     

大肠杆菌表达重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的中试纯化

重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (rHuGM -CSF)表达产物在大肠杆菌中以包涵体的形式存在。方法　包涵体高压匀浆破菌抽提后 ,经凝胶过滤层析、复性、离子交换层析及凝胶过滤层析等纯化步骤。结果终产物纯度达 97% ,比活性达 1 2× 10 7U/mg蛋白 ,测定N端 2 0个氨基酸系列与其DNA系列推导的氨基酸系列完全一致。     

重组人白介素21的表达、分离纯化及其体外生物活性的检测

白介素21(IL-21)是最新发现的与白介素2,白介素14和白介素15结构和序列同源的细胞因子.对于T细胞、B细胞和NK细胞有提高免疫应答等多种生物学活性.所以白介素21特别是人源白介素是一个抗肿瘤治疗和其他免疫治疗的一个潜在活性蛋白.为进一步研究IL-21,从刺激过的人外周血单核细胞中成功克隆成熟人白介素21编码基因,经过大肠杆菌密码子偏好的生物信息学分析、突变密码子、转化、诱导和CM-52阳离子交换柱分离纯化,实现了重组人白介素21蛋白在pET22b系统中的无标签表达.并将重组蛋白应用于淋巴细胞增殖实验和直接抗肿瘤(HepG2,K562和MDA)活性检测体外活性检测.结果表明,淋巴细胞增殖与重组人白介素21浓度成正相关,而r hIL-21对人肿瘤细胞无直接抗肿瘤活性.     

蛋白质纯化的方法选择

随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易[1].但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品.相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性.纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好.这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白.在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性.本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导.     

重组肝素酶I在大肠杆菌中的表达及纯化

优化肝素裂解酶I在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重组表达条件,结果显示接种6 h(OD600≈2.5)后加入0.25 mmol/L IPTG,在25℃下表达8 h目标蛋白酶活达到最高值1.49×105IU/L。进一步于5 L发酵罐中扩大培养,20 h后最高酶活达到5.55×105IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素裂解酶I的纯度可达到96%,回收率为37.58%,比酶活达到1.12×103IU/mg。肝素裂解酶I的高效表达为大规模利用酶法制备低分子肝素打下了坚实的基础。     

粒／巨噬细胞集落刺激生长因子在大肠杆菌内的表达及纯化

位／巨噬细胞集落刺激生长因子（GM－CSF）是最早发现的造血生长因子之一。美国FDA已批准重组人GM－CSF进入临床及市场，用于治疗艾滋病、肿瘤及白细胞减少等疾病。要获得大量均一的天然GM－CSF比较困难。1985年Wong及Lee分别克隆了人GM－CSF的CDNA，并在COS细胞内表达成功。19     

高效液相亲和层析介质的制备和对基因重组α-干扰素的纯化

以硅胶为基质，经表面改性和单克隆抗体固定化，制备了高效液相亲和层析介质。在改性反应中，以γ-缩甘油氧基丙基三甲氧基硅烷为改性剂，比较了水相法键合与有机相法键合的硅烷化率。用合成的α干扰素单克隆抗体高效液相亲和介质纯化由大肠杆菌表达的基因重组人α干扰素，层析过程的活性回收率为94％，纯化倍数为79倍，比活为7.94×106IU／mg。     

蛋白质分离纯化方法研究进展

蛋白质是生物体内含量最高、功能最重要的生物大分子,其分离纯化方法已成为目前的研究热点之一.该文依据蛋白质的物理、化学和生物学特性.从蛋白质分子的大小、溶解度、电荷性质等方面,同时结合高效液相色谱法在蛋白质分离纯化中的应用,对其进行了综述.     

发酵液中重组人血清白蛋白的纯化

采用摇瓶培养重组毕赤氏酵母（Pichia pastoris）表达并分泌重组人血清白蛋白（recombinant human se-rum alburmin，rHSA）至胞外，发酵液经（NH4）2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤分离纯化rHSA，纯化样品经SDS-PAGE检测为单一条带。