聚合酶链反应快速检测念珠菌属

病原真菌因具有特殊的细胞壁结构,故聚合酶链反应(PCR)检测方法自建立以来一直需要经过反复的真菌破壁和DNA抽提过程才能获取提纯的DNA,以进行下一步的PCR检测^[1-3].近来有学者已使用基因释放剂、CTAB及异硫氰酸胍等^[4-6]对真菌菌株或临床标本进行前期处理,然后进行PCR检测,但这仍需要配制复杂的原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液^[6]等,或者高额购买商品化的基因释放剂^[4,5],这不仅需要较高的技术要求、较大的实验成本、经过一定训练的技术人员,还要历经较长的实验时间,严重限制了真菌病PCR检测方法在临床的应用和普及.     

用任意引物聚合酶链反应进行皮肤癣菌的分子生物学研究

目的 探讨任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）方法对皮肤癣菌的分子生物学鉴定和分型的意义。方法 用随机引物OPAA115′-ACCCCACCTG-3′，OPD185′-GAGAGCCAAC-3′对皮肤癣菌的3个属9个种和孢子丝菌及白念珠菌共64个菌株进行AP-PCR，并对扩增产物进行电泳分析。结果 皮肤癣菌所试验的9个菌种之间均产生具有明显差异的电泳带型，来自不同地区的红色毛癣菌丝多次实验均出现主带相同的电泳带型，同时存在株间差异。结论 以OPAA11和OPD18为引物，用AP-PCR可对皮肤癣菌从基因分子水平上进行鉴别。并为分型提供依据。     

用任意引物聚合酶链反应进行皮肤癣菌的子生物学研究

目的探讨任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)方法对皮肤癣菌的分子生物学鉴定和分型的意义。方法用随机引物OPAA115'-ACCCGACCTG-3',OPD185'-GAGAGCCAAC-3'对皮肤癣菌的3个属9个种和孢子丝菌及白念珠菌共64个菌株进行AP-PCR,并对扩增产物进行电泳分析。结果皮肤癣菌所试验的9个菌种之间均产生具有明显差异的电泳带型。来自不同地区的红色毛癣菌经多次实验均出现主带相同的电泳带型,同时存在株间差异。结论以OPAA11和OPD18为引物,用AP-PCR可对皮肤癣菌从基因分子水平上进行鉴别,并为分型提供依据。     

任意引物聚合酶链反应对致病性地霉株间分型的鉴定

目的采用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)对部分致病性地霉进行分子生物学方面的鉴定。方法用E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取地霉菌基因组DNA,采用任意引物S034(5′-TCTGTGCTGG-3′),S040(5′-GTTGCGATCC-3′),S167(5′-CAGCGACAAG-3′),S368(5′-GAACACTGGG-3′)对临床上致病性白地霉、林生地霉皮损株和血液株的基因组DNA进行扩增,对各病原菌的DNA指纹的特征进行分析。结果扩增产物电泳分析发现不同种真菌的DNA经扩增后显示不同的DNA带型,尤其是使用引物S040,S167和S368扩增产生的DNA带型种间差异较明显;分离自不同感染部位的同种不同株真菌的DNA经扩增后显示的主要DNA带型也有明显差异,如使用引物S040和S368扩增产生的DNA带型种内差异较明显。结论以任意引物S034,S040,S167,S368为基础的AP-PCR技术可作为临床上致病性地霉的种间及种内鉴定的简单、快速、可靠的方法。     

真菌特异性通用引物的聚合酶链反应系统的实验与临床研究

目的　为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法　设计了一个以热启动聚合酶链反应 (PCR)为基础的实验方法 ,以一段真菌特异性DNA序列作为通用引物进行检测。引物序列为 :①AACTTAAAGGAATTGACGGAAG ;②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC。结果　该法能在 3小时之内对所用的全部 2 3种共 42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的 2 2份临床标本成功地扩增出一条310bp的DNA片段 ,但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高 ,特异性强。结论　采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动PCR技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。     

用聚合酶链反应进行红色毛癣菌种内分型

目的 建立一种快速且可重复的方法应用于红色毛癣菌的菌株区分。方法 PCR扩增20株红色毛癣菌核糖体基因的非转录间隔区内的两个串联重复亚单位trs-1,trs-2，克隆两段PCR产物，用PGEM-T载体构建重组质粒载体进行目的基因测序。结果 特异性扩增trs-1和trs-2区产生菌株特征的条带图，两个串联重复亚单位的基因测序结果说明了PCR指纹图差异的原因。结论 这种PCR方法产生的特征性的指纹图提供了一种快速，稳定的分子分型方法，可应用于红色毛癣菌感染的流行病学和致病性的进一步研究。     

实时荧光定量PCR快速鉴定五种常见念珠菌

[摘要] 目的 建立实时荧光定量PCR快速检测和鉴定五种常见念珠菌的方法并探讨其可行性。方法 应用真菌通用引物ITS4和ITS86,分别构建五种常见念珠菌重组质粒,进行实时荧光定量PCR检测,绘制融解温度曲线图,并对融解温度进行统计学分析。结果 五种常见念珠菌融解温度为：（87.33±0.13）℃（白念珠菌）、（84.39±0.20）℃（热带念珠菌）、（85.53±0.18）℃（近平滑）、（86.47±0.10）℃（光滑念珠菌）、（91.41±0.18）℃（克柔念珠菌）。结论：本研究显示实时荧光定量PCR方法可快速检测和鉴定五种常见念珠菌。     

一种快速鉴定光滑念珠菌与热带念珠菌的方法

目的：探讨一种快速检测光滑念珠菌与热带念珠菌的方法。方法：试验菌株经API 20、科玛嘉色原法、玉米吐温琼脂鉴定后,并以传统发酵法检测光滑念珠菌、白念珠菌、热带念珠菌发酵海藻糖情况。采用4％海藻糖液孵育各试验株3小时后用尿糖试纸检测。E－test法测试光滑念珠菌对氟康唑、伊曲康唑的敏感性。结果：光滑念珠菌与热带念珠菌皆可发酵海藻糖,尿糖试纸呈阳性反应,但后者菌落在科玛嘉色原培基为蓝色,在米粉吐温琼脂有假菌丝。结论：采用海藻糖法配合米粉吐温琼脂或科玛嘉色原培养基可以快速简便鉴定光滑念珠菌和热带念珠菌。     

Rapid identification of Candida albicans and its related species Candida stellatoidea and Candida dubliniensis by a single PCR amplification using primers specific for the repetitive sequence (RPS) of Candida albicans

BACKGROUND: Candidiasis is caused by several Candida species, of which Candida stellatoidea and C. dubliniensis are phenotypically close to C. albicans. Although current molecular biology-based techniques can distinguish between C. albicans and C. dubliniensis, a convenient tool that can distinguish C. stellatoidea from C. albicans has not yet been developed. OBJECTIVE: To develop a system that can simply, rapidly and specifically distinguish C. albicans from the related Candida species C. stellatoidea and C. dubliniensis. MATERIALS: Genomic DNAs were purified from various yeast species and amplified by primers specific for the repetitive sequence (RPS) of C. albicans. The PCR products were purified and sequenced in order to test the specificity of the PCR amplification. RESULTS: The PCR primers only amplified several products from C. albicans, C. stellatoidea and C. dubliniensis. Sequence analysis of the products revealed that C. stellatoidea and C. dubliniensis both had RPSs including alt repeats, similar to C. albicans. After the PCR amplification, each of the three Candida species showed a unique amplification profile. Furthermore, RFLP analysis of the PCR products using EcoRI and ClaI produced species-specific restriction profiles. CONCLUSIONS: This PCR-based technique targeting the alt repeats in the RPS is useful as a tool for the rapid identification and distinction of C. albicans, C. stellatoidea and C. dubliniensis.     

PCR检测部分病原真菌的实验研究

为探讨和评价ＰＣＲ技术在检测和鉴定病原真菌方面的作用,重点是引物的选择。首先比较了来自ｒＤＮＡ基因序列的通用引物的通用性,并用３对种特异性引物进行２次套式扩增。结果表明３对通用引物均能扩增出预期的靶ＤＮＡ带,平均大小分别为６２０ｂｐ,４８５ｂｐ和５８０ｂｐ;３对种特异性引物分别扩增出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉ＤＮＡ,并提高了敏感性。说明用通用引物和种特异引物进行ＰＣＲ扩增可以用于病原真菌的检测和     

多重PCR技术快速鉴定血培养阳性标本中酵母菌菌种的应用研究

目的：探讨多重PCR技术在快速鉴定引起真菌血症的重要医学酵母菌中的应用。方法：扩增酵母菌位于18S rRNA和5．8S rRNA基因之间的内转录间区（ITS）1的片段,以及白念珠菌位于ITS2区的特殊DNA片段,建立多重PCR方法,并鉴定血培养液中的酵母菌。结果：通过扩增片段长度分析显示光滑念珠菌482bp,季也蒙念珠菌248bp,近平滑念珠菌229bp,白念珠菌218bp和110bp,热带念珠菌219bp,新生隐球菌201bp,克柔念珠菌182bp。采用多重PCR方法共检测29例患者47份血培养阳性标本共50个分离株,其中白念珠菌27株,热带念珠菌8株,光滑念珠菌4株,近平滑念珠菌4株,新生隐球菌2株,克柔念珠菌1株,季也蒙念珠菌1株,均与培养鉴定结果一致,实验敏感性96％（47／50）,特异性100％。多重PCR实验检测全过程共需8h。结论：多重PCR方法快速、敏感、特异,有助于播散眭念珠菌感染的早期诊断,具有较好的应用前景。     

Atypical presentation of Old-World cutaneous leishmaniasis, diagnosis and species identification by PCR

Background  The diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL) is traditionally based on microscopic demonstration of amastigote forms in tissue biopsies or smears. However, this method usually presents low sensitivity, and in atypical forms, CL may be overlooked because of similarity to other dermal diseases. Thus, it is necessary to apply specific diagnostic methods as polymerase chain reaction (PCR).
Objective  To evaluate the possible advantage of PCR in the diagnosis and species identification of CL in patients with atypical clinical presentation.
Methods  Fifty-one patients clinically suspected of CL with positive and negative controls were tested. After microscopic examination, extraction of DNA was performed on their smears and analysed by two specific PCR assays for diagnosis and species identification. For these methods, conserved and variable regions of kinetoplastic DNA (KDNA) of Leishmania species have been amplified, respectively. Atypical forms of CL were evaluated among PCR-positive patients.
Results  PCR results were positive in 37 out of 51 cases (72.5%), among whom microscopic examination revealed Leishmania amastigotes in only 3 (5.9%). Among these patients, 10 (27%) had atypical presentation of CL; using species-specific primers, 6 patients had Leishmania major , 3 had Leishmania tropica and 1 patient had no species diagnosis. None of the samples of other dermal diseases revealed positive results (specificity, 100%). All patients were successfully treated by CL-specific drug regimens.
Discussion  The results showed that KDNA PCR methods have a higher sensitivity compared with microscopic method. Moreover, PCR could identify the parasite species for specific therapy. Microscopic method had low sensitivity and less value in chronic and atypical CL cases.     

聚合酶链反应快速检测丝状真菌

目的　建立并评价一种新的丝状真菌的快速PCR检测方法。方法　将 13种培养的不同丝状真菌菌种经匀浆器研磨处理后直接放入一个新建立的PCR体系 ,用 2对真菌通用引物进行PCR扩增。结果　 13种不同的丝状真菌菌种均在 2h内通过该PCR方法成功地获得了靶DNA的扩增 ,无需任何DNA抽提步骤 ,可用于直接扩增处于任何生长期的未经处理的丝状真菌DNA。结论　此法简便、快速 ,敏感性、特异性均高 ,对丝状真菌引起的深部真菌感染的早期诊断将具潜在意义。     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

PCR方法快速检测一些常见医学真菌

目的 为选择一种快速、敏感和特异的方法来检测临床感染的真菌。方法 选取真菌１８ＳｒＤＮＡ序列中两个片段设计引物,对１２种菌株进行ＰＣＲ扩增,均扩增出长约３１０ｂｐ产物。对一些临床常见细菌扩增均无反应。对酶母相真菌白念珠菌、新生隐球菌进行敏感性实验检测。结果 发现二者ＰＣＲ最小检出量均为菌体数达每个反应体系１０＾３。本实验过程总耗时３６ｈ以内。结论 本实验方法可快速特异性检测一些常见医学真菌。     

流式细胞计数用于念珠菌的快速药敏试验研究

目的 探索应用流式细胞计数(FCM)进行念珠菌快速药敏试验.方法 参照M27-A标准化方案,应用FCM检测氟康唑(FCZ)对21株念珠菌的抗菌活性,药物作用时间3h,非渗透性荧光染料碘化丙啶(PI)染色0.5h.根据不同药物浓度作用下各药物浓度管荧光强度的梯度变化趋势,将平均荧光均道值大于生长对照管60%的最小药物浓度设定为最小抑菌浓度,即MIC值.并将结果与M27-A标准化方案进行比较.结果 FCM所测MIC值范围在0.125~64μg/mL之间,M27-A标准化方案所测MIC值在0.25~64μg/mL之间,统计学检验两者差异无显著性(P>0.05),结果有很好的一致性.FCM试验全过程仅需4h左右.结论 FCM药敏试验具有快速、敏感、可靠的优势.