肺孢子虫感染大鼠模型的建立及ITS巢式PCR检测敏感性研究

目的 建立肺孢子虫感染大鼠模型并探讨ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫DNA的敏感性. 方法 大鼠分为实验组和对照组,实验组从第1周开始用每周2次每次每只皮下注射地塞米松1 mg的方法诱导,共8周,并分别在首次注射后第2、4、6、8周解剖大鼠制作肺印片、肺组织匀浆液及支气管肺泡灌洗液(BAL)涂片,并进行六亚甲基四胺银(Gomori's methenamine silver,GMS)染色镜检;对照组不作激素注射,并分别在0周和第10周剖杀染色检查.同时分别提取大鼠BAL和肺组织的肺孢子虫DNA进行巢式PCR扩增,比较GMS法和ITS巢式PCR检测的敏感性. 结果 实验组从第6周开始染色镜检,可见少量肺孢子虫包囊,第8周肺印片、肺组织匀浆液均检测到包囊,检出率为100%(10/10),BAL的检出率为80%(8/10),对照组则均未检出.用ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR法均能检测出实验组第8周大鼠BAL和肺组织卡氏肺孢子虫DNA,阳性率为100%(10/10),对照组均为阴性.比较BAL标本、肺印片和肺组织匀浆液GMS染色法的检出率,BAL最低,肺组织匀浆液最高.其中20%(2/10)大鼠的BAL标本用GMS染色法未能检出,但用巢式PCR方法均能成功扩增.结论成功用地塞米松诱导法建立了肺孢子虫大鼠感染模型;ITS1-5.8S rDNA-ITS2巢式PCR检测卡氏肺孢子虫敏感性高、特异性强,可推广应用于临床诊断肺孢子虫肺炎.     

大鼠肺孢子虫肺炎动物模型的实验研究

目的建立肺孢子虫肺炎(PCP)的大鼠实验动物模型。方法将34只雌性清洁级SD大鼠随机分成实验组和对照组,每组17只。实验组采取每周2次每次每只皮下注射地塞米松1mg诱导的方法建立PCP动物模型;对照组则注射与地塞米松等体积的灭菌生理盐水。所有大鼠的饮水中加入1g/L盐酸四环素预防继发性细菌感染。12周后解剖全部大鼠,并分别制作肺组织印片,姬氏染色,检查肺孢子虫包囊。同时制作肺组织病理切片,HE染色,观察肺组织的病理学变化。结果用地塞米松诱导大鼠5周,肺组织印片均查见肺孢子虫包囊,肺组织也出现典型的病理学改变。连续诱导12周,均未见实验鼠死亡。实验组大鼠体重下降明显,与对照组比较,差异有非常显著性(P<0.01)。结论应用皮下注射地塞米松免疫抑制诱导的方法可成功建立PCP的大鼠动物模型。     

卡氏肺孢子虫低死亡率SD大鼠动物模型的建立

目的建立低死亡率卡氏肺孢子虫肺炎(PCP) SD 大鼠动物模型. 方法将雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组采用按体重定量皮下注射地塞米松免疫抑制的方法诱导建立PCP动物模型,对照组注射与地塞米松等体积的生理盐水.分别制作肺印片,经瑞-姬氏复合染色后,检查卡氏肺孢子虫包囊.制作肺组织病理切片,经HE染色后观察肺组织病理变化.制作感染大鼠肺组织超薄切片,透射电镜观察Pc包囊和滋养体. 结果用地塞米松诱导后,实验组SD大鼠死亡率为0,肺印片阳性率为76.7%(23/30).肺组织出现典型的病理变化,并可观察到Pc包囊.实验组SD大鼠体重下降明显,与对照组体重比较具有极显著性差异(P<0.01).电镜下可观察到Pc包囊和滋养体的形态结构. 结论采用按体重定量皮下注射地塞米松的方法可建立低死亡率PCP动物模型.     

锌对大鼠感染卡氏肺孢子虫的影响初探

目的探讨锌对大鼠感染卡氏肺孢子虫的影响。方法将30只SD大鼠随机等分为A、B、C三组。A、B二组每只大鼠皮下注射地塞米松1mg/次,每周2次,诱导感染卡氏肺孢子虫。B组同时给予硫酸锌。C组为对照组。第8周将各组大鼠处死,取肺组织印片,检查包囊。结果锌对诱导产生的大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的严重程度有所减轻。结论锌对大鼠感染卡氏肺孢子虫有一定影响,值得进一步深入研究。     

大鼠肺微量元素变化与卡氏肺孢子虫感染关系的探讨

目的　检测卡氏肺孢子虫感染对大鼠肺组织 6种微量元素 (Ca+ + 、Mg+ + 、Fe+ + 、Cu+ + 、Zn+ + 、Mn+ + )的影响。方法　 30只SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组每只大鼠皮下注射地塞米松 1mg/次 ,每周 2次 ,诱导卡氏肺孢子虫感染。 10周后将大鼠处死 ,取肺组织 ,用原子吸收分光光度计测定其微量元素的变化。结果　与PCP阴性组及对照组相比较 ,感染组肺组织中Zn+ + 的含量明显低于对照组 (P <0 0 5 ) ,Ca+ + 、Mg+ + 的含量明显高于对照组 (P <0 0 1～ 0 0 5 ) ,Fe+ + 、Cu+ + 、Mn+ + 的含量变化不明显。结论　卡氏肺孢子虫感染能引起大鼠肺组织微量元素的变化。     

卡氏肺孢子虫感染的免疫诊断研究

目的：探讨肺泡灌洗液、血清抗原及血清抗体检测诊断卡氏肺孢子虫感染的价值。方法：利用免疫抑制大鼠模型及双夹心ELISA法检测不同时期感染大鼠肺泡灌洗液和血清中肺孢子虫抗原，用IFA法检测血清中的肺孢子虫IgG抗体，并与病原学检查结果进行比较。结果：感染大鼠肺泡灌洗液的抗原检测于免疫抑制6－8wk后均呈阳性，而对照组大鼠均呈阴性；大多数感染大鼠血清抗原检测为阴性；正常大鼠血清中有低滴度肺孢子虫IgG抗体，感染大鼠抗体滴度轻度升高或不升高，但中止免疫抑制后血清抗体滴度明显升高，而肺泡灌洗液中抗原逐渐阴转。结论：肺泡灌洗液抗原检测可用于肺孢子虫感染的诊断，但血清中很难检出这种抗原；血清IgG抗体的上升并不表示为现症感染.     

卡氏肺孢子虫感染的实验研究

为探索卡氏肺孢子虫肺炎的发病机制，将大鼠分为实验组和对照组。给予实验组大鼠肌注地塞米松以诱发肺孢子虫肺炎。每周剖杀，光镜及电镜下对其两组大鼠肺组织进行病原学和病理学观察，对照组大鼠健康，第８ｗｋ后体重增加４５％，肺组织未见病理改变，亦未观察到卡氏肺孢子虫。实验组大鼠慢性发病，８ｗｋ后体重比原来减少约２６％，电镜下第４ｗｋ，光镜下第５ｗｋ开始查见卡氏肺孢子虫，第７￣８ｗｋ达重度感染，阳性率为６６．７     

卡氏肺孢子虫感染的免疫诊断研究

目的：探讨肺泡灌洗液、血清抗原及血清抗体检测诊断卡氏肺孢子虫感染的价值。方法：利用免疫抑制大鼠模型及双夹心ＥＬＩＳＡ法检测不同时期感染大鼠肺泡灌洗液和血清中肺孢子虫抗原，用ＩＦＡ法检测血清中的肺孢子虫ＩｇＧ抗体，并与病原学检查结果进行比较。结果：感染大鼠肺泡灌洗液的抗原检测于免疫抑制６－８ｗｋ后均呈阳性，而对照组大鼠均呈阴性；大多数感染大鼠血清抗原检测为阴性；正常大鼠血清中有低滴度肺孢子虫ＩｇＧ抗体，感染大鼠抗体滴度轻度升高或不升高，但中止免疫抑制后血清抗体滴度明显升高，而肺泡灌洗液中抗原逐渐阴转。结论：肺泡灌洗液抗原检测可用于肺孢子虫感染的诊断，但血清中很难检出这种抗原；血清ＩｇＧ抗体的上升并不表示为现症感染。     

卡氏肺孢子虫感染大鼠血清中酶学变化及意义

目的探讨卡氏肺孢子虫(PC)感染大鼠血清中酶学变化的意义。方法应用地塞米松诱导建立卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)大鼠模型(PCP组),于造模前(0周)及造模后3、6、9、12周断尾取血,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;于12周后采集肺泡灌洗液(BALF)检测ALT、AST、ALP、LDH水平。结果PCP组血清ALP、AST水平从造模第3周以后显著高于正常对照组(P<0.05),ALT及LDH水平无明显规律性变化。结论ALP、AST可作为PCP感染的辅助诊断指标。     

大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的实验病理学研究

目的　动态观察大鼠卡氏肺孢子虫肺炎不同病程的病理学变化。方法　将 4 0只清洁级 5 0的雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组。前者皮下注射地塞米松磷酸钠 ,每周 2次 ,1mg/次 ,共 12周 ;后者皮下注射相同剂量的生理盐水。观察两组大鼠的发病情况并每隔 3周两组各取 5只动物进行病原学、病理学检查。结果　实验组大鼠 5周后开始发病 ,肺印片中可查到卡氏肺孢子虫包囊及滋养体 ,其组织病理学观察可见间质性肺炎随诱导时间存在明显病理学改变。实验组大鼠第 6周主要表现为肺泡壁毛细血管轻度充血 ,间质内慢性炎性细胞浸润 ;第 9至 12周可见间质细胞增生、间质水肿、肺泡内出现粉红色泡沫样渗出物、部分肺组织呈现大片状实变区。对照组大鼠无异常表现 ,病原学检查阴性 ,肺部无明显病理学改变。结论　大鼠卡氏肺孢子虫肺炎以炎症、渗出、细胞浸润、间质细胞增生等为主并随病程存在明显病理学改变     

SPA-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原的研究

目的 探讨SPAK-ELISA检测卡氏肺孢子虫抗原对诊断卡氏肺孢子虫肺炎的价值。 方法 采用SPA-ELISA检测免疫抑制大鼠模型在不同时期肺泡灌洗液(BALF)和血清中肺孢子虫(PC)抗原,以及造血干细胞移植并发肺炎患者痰液和血清抗原,并与病原学检查结果比较。 结果 感染大鼠于用药后第4周,BALF中PC抗原,以及肺组织印片和BALF涂片包囊检查开始出现阳性,但前者阳性率(60％)高于后者(20％和40％),而且全部阳性达到的时间(8周)也早于后者(10周)。第10周有2只鼠血清抗原阳性,但此后又转阴。30例肺炎患者痰液抗原阳性8例,阳性率为26.67％,8例抗原阳性患者中只有3例发现包囊,符合率为37.5％。血清抗原检测全部阴性。 结论 SPA-ELISA检测痰液和肺泡灌洗液抗原比病原学检查敏感性高,而检测血清抗原不适用于诊断卡氏肺孢子虫肺炎。     

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。     

青蒿素衍生物对卡氏肺孢子虫基因的影响

目的　研究双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯对卡氏肺孢子虫 5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因 (mtLSUrRNA)、胸腺嘧啶核苷酸合成酶 (TS)基因的影响。方法　以上述 3种药物治疗实验大鼠肺孢子虫肺炎 ,治疗结束后收集鼠肺 ,以酚 -氯仿抽提法抽提肺总DNA。以PCR方法扩增肺孢子虫的上述 3基因 ,以双脱氧末端终止法测定PCR产物的核苷酸序列 ,并研究双氢青蒿素对基因序列的影响。结果　 3种药物作用过的虫体均未见TS基因扩增产物 ,部分虫体无 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因扩增产物。经双氢青蒿素作用过的与正常肺孢子虫的 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因分别有16 5 %、15 .2 %序列差异。结论 3种青蒿素衍生物可破坏肺孢子虫TS基因。双氢青蒿素可致 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因序列发生变异     

卡氏肺孢子虫肺炎肺灌洗液细胞和生化成分变化的研究

目的 研究卡氏肺孢子虫肺炎（ＰＣＲ）支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中细胞和生化成分的变化及与细菌性肺炎的差别。方法 采用清洁级Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠５０只,每周２次皮下注射泼尼松建立ＰＣＰ模型（１４只）,阴性对照组（６只）,细菌性肺炎组（１１只）为实验组,并设正常对照组（６只）。     

长爪沙鼠和新西兰白兔源肺孢子虫ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的测定与分析

目的测定长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列,并与大鼠源肺孢子虫的相应序列进行比较分析。方法用地塞米松免疫抑制法诱导长爪沙鼠和新西兰白兔感染肺孢子虫;制作肺印片进行瑞-姬氏复合染色,通过镜检初步了解感染情况;提取肺孢子虫总DNA,设计合成引物进行PCR扩增;纯化扩增产物后克隆测序;与登录Gen-Bank的大鼠源肺孢子虫相关序列进行比较分析。结果长爪沙鼠源肺孢子虫的ITS1、5.8S rDNA和ITS2基因序列长分别为158、157和172bp,新西兰白兔源肺孢子虫的相应序列分别为129、158和178bp。结论本实验测得的长爪沙鼠及新西兰白兔源肺孢子虫的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列以往未曾报道,此结果为肺孢子虫的遗传学研究提供了新的资料。     

大鼠卡氏肺孢子虫的三个基因序列分析

目的 分析我国大鼠源卡氏肺孢子虫的基因序列特征。方法：以Wistar大鼠建立肺孢子虫肺炎动物模型,收集鼠肺,抽提DNA,以PCR方法扩增卡氏肺孢子虫的5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因（mtLSU rRNA）、胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因（TS）。纯化扩增产物,直接测序。检索基因库（GenBank）,进行序列比较。结果 三个基因的PCR扩增呈阳性。感染Wistar大鼠的卡氏肺孢子虫5S rRNA基因与gb|S78185|S78185、gb|M28193|PMCRAA两个序列同源性分别为93.3%和91.7%;mtLSU rRNA基因与gb|U20173|PCU20173 、gb|U20169|PCU20169两个序列同源性分别为76.2%和55.2%;TS基因与gb|M25415|PMCTHYSY、gb|S77510|S77510两个序列同源性均为90.9%。结论 Wistar大鼠感染的卡氏肺孢子虫的三个基因与GenBank内的相应基因序列同源性较高。     

卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型的比较研究

目的　比较用SpragueDawley(SD)大鼠和Wistar大鼠建立卡氏肺孢子虫肺炎 (PCP)模型的差异。 方法　选用SD大鼠和Wistar大鼠 ,随机分为实验组和对照组 ,免疫抑制诱导建立动物模型 ;收集肺组织和支气管肺泡灌洗液 (BALF) ,分别制成肺印片和BALF涂片 ,作Giemsa染色 ,镜检卡氏肺孢子虫滋养体和包囊。结果　共收集实验组SD大鼠和Wistar大鼠的肺组织及BALF标本各 2 8份 ,经Giemsa染色后 ,在肺印片中查见Pneumocystiscarinii(Pc)虫体的阳性率分别为 89.2 9%和10 0 % ,两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;BALF阳性率分别为 6 0 .71%和 78.5 7% ,两者之间亦无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而同种大鼠的肺印片与BALF涂片 ,其阳性率之间有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,且肺印片的检出率均显著高于BALF涂片。同种大鼠不同肺叶的肺印片 ,其阳性率之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　SD大鼠与Wistar大鼠作为PCP模型动物无明显差别     

妊娠期大鼠对卡氏肺孢子菌的易感性研究

目的研究妊娠期大鼠对卡氏肺孢子菌（Pneumocystiscarinii,PC）的易感性,为妇女孕期保健及优生优育提供参考。方法采用皮下注射地塞米松的方法建立大鼠肺孢子菌肺炎（pneumocystispneumonia,PCP）模型,作为环境中Pc的感染来源。于实验的第6周处死2只PCP大鼠,取肺组织印片,用改良四胺银（GMS）染色,镜检Pc的感染情况。妊娠组、非妊娠组大鼠各取10只,于实验的第6周末将鼠笼置于PCP模型大鼠的鼠笼两侧,实验第7、8、9周分别取3只、3只和4只妊娠组及非妊娠组大鼠,乙醚麻醉下处死并取肺组织,提取DNA,PCR扩增Pc的mtI。SUrRNA。结果PCP模型组大鼠肺印片GMS染色后油镜下观察,可见大量Pc包囊,证明PCP模型建立成功。PCR扩增妊娠组8只大鼠Pc阳性,感染率为80．00％（8／10）;非妊娠组6只大鼠Pc阳性,感染率60．O¨0％（6／10）。经Fisher确切概率法检验,两组大鼠的Pc感染率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论健康妊娠期大鼠对外源性Pc普遍易感,但感染率与非妊娠女鼠无明显善别．     

肺孢子菌动物模型的建立及病原学和分子生物学检测技术研究

目的 目的 建立肺孢子菌动物模型, 并对肺孢子菌病原学和分子生物学检测技术进行研究。方法 方法 SD和Wistar大 鼠随机分为实验组和对照组, 实验组大鼠皮下注射地塞米松, 对照组皮下注射生理盐水。诱导8周后处死全部大鼠, 收 集其支气管肺泡灌洗液 （BALF） 和肺组织, 分别做涂片和肺印片, 染色后镜检。用FTA卡采集所有大鼠的BALF进行PCR 检测。对PCR产物进行测序, 利用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库中的鼠源性肺孢子菌进行比对, 确定菌 种。结果 结果 共采集肺组织标本和BALF 各34份, 病原学检测显示实验组总感染率为29.2% （7/24）, 对照组感染率为0; 其 中SD和Wistar大鼠实验组感染率分别为25.0% （3/12） 和33.3% （4/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.31）; 实验组SD大鼠肺印 片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别为25.0% （3/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.34）。实验组Wistar大鼠 肺印片和BALF 肺孢子菌阳性检出率分别33.3% （4/12） 和16.7% （2/12）, 差异无统计学意义 （P = 0.24）。用PCR方法共检 测28份大鼠BALF样本, 实验组阳性检出率为91.7% （26/28）, 对照组均为阴性。对PCR产物进行测序分析, 发现其与 GenBank 已登录的大鼠源肺孢子菌 （JX499145、 GU133622、 EF646865） 的同源性均为100%。结论 结论 通过皮下注射地塞米 松可以建立肺孢子菌动物模型, SD大鼠与Wistar大鼠在作为肺孢子菌动物模型的选择上无显著差别。在早期感染阶 段, 适宜用PCR法进行肺孢子菌检测, 病原形态学检测漏检率高。