人β防御素-2稳定表达细胞株的建立及其表达产物对耐药大肠埃希菌抗菌活性研究

目的建立稳定表达人β防御素2(hBD2)的COS-7细胞株,并检测其表达产物对耐药大肠埃希菌的抗菌活性。方法将重组hBD2真核表达载体pCMV-hBD2通过脂质体转染COS-7细胞,筛选稳定表达hBD2单克隆细胞株;经RT-PCR和Western blot检测稳定转染后目的基因在转录水平和蛋白水平的表达;用微量稀释法检测稳定转染后细胞培养上清液对耐药大肠埃希菌的抗菌作用。结果筛选出稳定表达hBD2的COS-7细胞株,检测到目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达,且其表达产物使耐药大肠埃希菌存活率降至15%。结论建立了稳定表达hBD2的COS-7细胞株,其表达产物对耐药大肠埃希菌具有一定的抗菌活性。     

脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子基因在体骨骼肌的转移和表达

目的：研究脂质体介导胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨骼肌内的表达。方法：将鼠 GDNF cDNA 克隆到真核表达载体 pEGFP 中,构建重组载体 pEGFP-GDNF;将脂质体和重组质粒 pEGFP-GD- NF cDNA 混合后直接注入大鼠面神经支配的骨骼肌内。采用免疫组化技术和荧光显微镜检测 GDNF 基因转染后的体内表达。结果：转染2 d 后,转染侧面肌细胞内有散在的绿色荧光,且有部分细胞呈 GDNF 免疫反应阳性,对照侧为阴性。结论：GDNF 基因能通过脂质体介导转入骨骼肌内并表达 GDNF 蛋白,为神经营养因子基因肌内转染治疗周围神经损伤提供了初步的理论和实验依据。     

体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立

目的:建立体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系.方法:利用分子克隆技术构建真核表达载体peDNA3-GFP-HEK2,阳离子脂质体介导法将其稳定转染入B16细胞,G418克隆筛选及体内传代后,流式细胞术(FCM)分选出GFP-HER2表达阳性细胞群,对该群细胞进行无G418条件下的单克隆筛选并进行体内稳定性检测.结果:经限制性内切酶鉴定及序列分析,peDNA3-GFP-HER2构建正确;最终建立的表达HER2基因B16细胞系体内传代后GFPHER2阳性率高于90%.结论:成功建立了体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系,为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的建立提供了借鉴.     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

β—葡萄糖醛酸苷酶基因转染人胆管癌细胞的生物学观察

目的 建立高表达β－葡萄糖醛酸苷酶（以下简称βＧ）基因的胆管癌模型,并观察转染βＧ基因的胆管癌细胞的超微结构及基因表达产物的定位。方法 构建真核表达的逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－βＧ。利用阳离子脂质体将其转入人胆管癌细胞株,经免疫组化染色和免疫电镜等检测其表达,并用民镜观察转染细胞超微结构的变化。结果 经Ｇ４１８筛选后的阳性细胞克隆,为高表达βＧ的胆管癌模型。免疫组织化学染色和免疫电镜证实,其在转染β     

miR-27a-3p靶向SnoN抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的作用

目的研究miR-27a-3p对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的影响并探讨其机制。方法运用qRT-PCR检测HK2细胞中miR-27a-3p的表达;将HG+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、HG+anti-miR-27a-3p组(转染anti-miR-27a-3p)、HG+pcDNA组(转染pcDNA)、HG+pcDNA-SnoN组(转染pcDNA-SnoN),均用脂质体转染至HK2细胞,并用D-葡萄糖(30mmol/L)处理48 h;Western blot检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、SnoN、TGF-β1、p-Smad2的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与低糖对照组相比,HG组细胞中miR-27a-3p显著升高,SnoN显著降低,Ecadherin、p-Smad2显著降低,N-cadherin、TGF-β1表达显著升高,(P0.05);抑制miR-27a-3p、过表达SnoN均可上调Ecadherin,下调N-cadherin,抑制HK2细胞EMT;SnoN是miR-27a-3p的靶点。过表达SnoN可下调TGF-β1,上调p-Smad2,失活TGF-1信号通路。结论 miR-27a-3p可抑制高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT,其机制可能与靶向SnoN失活TGF-β1信号通路有关,将可为糖尿病肾病的治疗提供依据。     

hBD1稳定表达细胞株的建立及其表达产物对多重耐药菌的活性检测

目的 构建人β防御素1( hBD1)稳定表达细胞株并检测其对多种多重耐药菌的抗菌活性.方法 将重组质粒pCMV-hBD1通过阳离子脂质体转染于非洲绿猴SV40转化的肾细胞(COS-7细胞),经过G418压力筛选后获得单克隆细胞株;提取细胞总RNA,用RT-PCR检测目的基因在转录水平的表达;收集细胞培养上清液,用Western blot检测hBD1基因蛋白的表达;将含有表达产物hBD1的细胞培养上清液分别同各耐药菌液混合,37℃孵育不同时间后涂布于LB平板,以各实验组和对照组的菌落数的比值作为该耐药菌的存活率.结果 经过G418压力筛选所得到的稳定表达细胞株,在转录水平和蛋白水平均检测到目的基因hBD1的表达,在表达产物hBD1的作用下,多重耐药鲍氏不动杆菌、多重耐药大肠埃希菌存活率和多重耐药肺炎克雷伯杆菌的存活率可以分别降至9%、22%和50%,多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌的存活率同对照组没有明显差异.结论 成功获得hBD1稳定表达细胞株,目的基因hBD1的表达产物对多种多重耐药菌均具有抗菌活性.     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察

目的：建立高表达β-葡萄糖醛酸苷酶(以下简称βG)基因的肾癌细胞模型，并观察转染细胞的生物学特性。方法：构建真核表达载体pcDNA3．1—βG，并利用阳离子脂质体介导将其转人人肾癌细胞株GRC—1中。用mRNA打点杂交和Westemblot，鉴定其转录与表达水平，并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法，观察转染细胞的生物学特性。结果：在mRNA与蛋白水平证实，转染细胞内有βG基因的高表达。透射电镜观察，转染细胞中的溶酶体、内质网丰富，细胞微绒毛及突起增多，但转染前后肾癌细胞GRC—1的周期及生长情况无显著性差别。结论：应用脂质体介导法，将βG基因导人人肾癌GRC—1细胞后，获得生物学特性稳定βG基因高表达的肾癌细胞模型，为进一步研究奠定了基础。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β -防御素 - 2基因的激活作用及其活性组分。 方法 :应用逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)法和Northern杂交检测HT - 2 9细胞hBD - 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT -PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT - 2 9细胞无可见的hBD - 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD - 2mRNA表达。结论 :双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD - 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用…     

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。     

半乳糖配体介导大鼠白介素10基因在大鼠肝脏内的靶向表达

目的 探讨大鼠白介素10(rIL-10)基因是否可通过半乳糖配体介导的脂质体转染法在大鼠肝脏内靶向表达.方法 将已构建好的rIL-10基因真核表达质粒与半乳糖配体转染试剂按jetPEI-Gal/DNA (N/P=10)比例混合,通过尾静脉注射转移至大鼠体内.RT-PCR法和ELISA法检测rIL-10基因转移至体内0 ...     

siRNA干扰 BMI-1 基因对膀胱癌EJ细胞增殖的调控作用及其机制

目的: 对比观察膀胱癌EJ细胞及人膀胱移行上皮细胞中 BMI-1 基因及下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的mRNA及蛋白表达水平,探讨siRNA干扰 BMI-1 基因后对EJ细胞增殖的影响及其调控机制。方法: 细胞免疫荧光观察BMI-1、p16^INK4a和p14^ARF蛋白在EJ细胞中表达情况及定位。Real-time RT-PCR检测EJ细胞及膀胱正常移行上皮细胞中3种基因的表达水平,Western blotting检测蛋白水平。构建干扰 BMI-1 基因siRNA,通过脂质体转染导入EJ细胞中,设立空白对照和阴性干扰对照组,检测 BMI-1 及下游 p16、p14 基因表达水平及蛋白表达水平的变化;以CCK-8检测细胞生长观察siRNA干扰 BMI-1 表达对EJ细胞增殖的抑制作用;用流式细胞术分析细胞凋亡的改变。结果: BMI-1mRNA及蛋白水平在EJ细胞表达高于膀胱移行上皮细胞,而p16^INK4a和p14^ARFmRNA及蛋白在EJ细胞表达水平稍低于膀胱移行上皮细胞。siRNA干扰 BMI-1 后可以上调EJ细胞中其下游p16和p14 mRNA及蛋白水平,使EJ细胞增殖能力下降,细胞凋亡增多。结论: siRNA干扰 BMI-1 基因表达对EJ细胞的体外生长具有明显的抑制作用,其作用机制与上调其下游 p16^INK4a、p14^ARF 基因的表达有关。     

脂质体介导质粒转染角朊细胞的影响因素

探讨利用脂质体介导真核表达质粒转染体外培养的人角朊细胞的最佳转染条件。体外分离培养正常人角朊细胞 ,培养至 6 0 %、70 %、80 %、90 %及 10 0 %融合时 ,应用不同浓度的LipofectAMINE包被真核表达质粒pCMV·SPORT β gal,分别转染 6、8、10、12及 2 4h。细胞经转染后再培养 48h ,行 β 半乳糖苷酶原位染色 ,镜下观察并计算阳性转染率。被转染的阳性细胞 ,可见质粒 β 半乳糖苷酶基因的良好表达 ;当细胞融合率为 80 %、90 % ,以12 5 μL/ 10 0 μL的LipofectAMINE包被 1 5 μg/ 10 0 μL的pCMV·SPORT β gal,转染时间为 8h的转染率最高 ,可分别达到 (31 35± 1 35 ) %、(32 32± 2 4) %。该实验说明LipofectAMINE可有效地介导真核表达质粒转染培养的人角朊细胞 ;转染率与细胞生长状态、脂质体包被质粒的浓度比例、及转染时间直接相关。     

脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法

目的：提高脂质体介导的细胞转染效率.方法：在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测.结果：流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率（26%、24%和40%）高于传统法转染的细胞（16%、16%和18%）.改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%.在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短.结论：改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在最短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株.     

大鼠IL-10基因真核表达质粒的构建及其在BRL细胞中的表达

目的:构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达,比较有无受体介导的脂质体的转染效率.方法:抽提外周血单个核细胞的总RNA,通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定.将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL,通过RT-PCR方法检测IL-10 mRNA的表达,比较二者的转染效率,用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达.结果:经酶切及测序鉴定证实,重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符.发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM .通过受体介导的脂质体转染,BRL细胞获得高水平的IL-10表达.结论:成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒.受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体.     

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体，将重组人绿色荧光蛋白表达载体（pAAV-IRES-GFP）外源DNA定向转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察外源基因的表达，比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1：1的比例混合转染可以得到很高的转染效率，过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。     

人α-防御素HNP1基因在气管上皮细胞转染的表达研究

目的　探讨人α防御素ＨＮＰ１ 基因在气管上皮细胞转染表达的可行性。方法　采用脂质体转染法将ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 导入无血清培养的人、兔气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 法及免疫组化法,分别在核酸水平及蛋白质水平检测ＨＮＰ１ 的表达。结果　用ＲＴＰＣＲ 在人和兔的转染上皮细胞总ＲＮＡ 提取物中均扩增出１ 条３１９ｂｐ 的ＤＮＡ 片段,与ＨＮＰ１ ｃＤＮＡ 片段大小一致, 而在未转染的上皮细胞总ＲＮＡ 中没有扩增出相应ＤＮＡ片段。免疫组化法检测到转染细胞呈强阳性反应,未转染细胞呈阴性反应,与ＲＴＰＣＲ 法检测的结果一致。结论　实验在ｍ ＲＮＡ 和蛋白质水平上均提示重组真核表达质粒ｐＢａｂｅＮｅｏＨＮＰ１ 转染气管粘膜上皮细胞后,能有效表达ＨＮＰ１ 分子。     

RNA干扰HAS2基因表达对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞生物学特性及免疫因子的影响

目的:探讨透明质酸合成酶2(HAS2)基因在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠表达及RNA干扰其表达对卵巢颗粒细胞活力、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1和VEGF表达的影响。方法:建立DHEA致雌性SD大鼠PCOS模型,Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织中HAS2的蛋白表达;培养原代PCOS大鼠卵巢颗粒细胞,将合成的靶向抑制HAS2表达的siRNA转染到细胞中,Western blot检测转染效果及转染后48 h各组细胞中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。CCK8及流式细胞仪分别检测细胞活力和凋亡率。结果:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,转染si-HAS2的大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2的表达显著低于NC组和对照组(P 0. 05);与NC组比较,si-HAS2组细胞活力显著降低,凋亡率增加,TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路p-NF-κB、p-IκBα和下游cyclin D1、survivin的蛋白表达均显著降低(P 0. 05)。结论:HAS2在PCOS大鼠卵巢组织中高表达,抑制大鼠卵巢颗粒细胞中HAS2表达可降低细胞活力,诱导细胞凋亡,下调免疫抑制因子TGF-β1、VEGF及NF-κB信号通路表达。     

大鼠β防御素2基因慢病毒载体的构建及功能检测

目的 构建大鼠β防御素2（rBD2）基因慢病毒表达载体,并转染培养细胞检测其表达,为rBD2研究及大鼠体内实验奠定基础.方法 提取大鼠上皮细胞总RNA,PCR扩增获得rBD2基因,双酶切PCR产物和慢病毒载体Lentivirus[含H1启动子和绿色荧光蛋白（GFP）],连接构成rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2,行测序鉴定.用慢病毒包装系统对LV-rBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度,病毒液感染培养细胞,RT-PCR和Western Blot检测rBD2表达.结果 凝胶电泳和测序结果表明rBD2基因克隆到慢病毒载体中,序列正确.完成慢病毒颗粒包装,调整病毒滴度至1×105ifu/μl.RT-PCR和Western-Blot显示rBD2基因获得表达.结论 rBD2基因慢病毒表达载体LV-rBD2被成功构建,能转染细胞并获得有效表达.     

Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究

背景：尾侧型同源转录因子2在消化道尤其是小肠与结肠上皮的发育中起到关键作用。 目的：构建尾侧型同源转录因子2反转录病毒表达载体pLNCX2- Cdx2,观察pLNCX2- Cdx2体外转染对人膀胱上皮细胞发生肠上皮化生的作用。 方法：应用基因重组技术将人尾侧型同源转录因子2cDNA克隆到反转录病毒载体pLXSN2,酶切鉴定,包装到PA317细胞中。转染人膀胱尿路上皮细胞,应用荧光PCR及Western blot检测尾侧型同源转录因子2以及绒毛蛋白、LI-cadherin的表达情况。 结果与结论：pLNCX2 -Cdx2成功构建;细胞转染后尾侧型同源转录因子2的mRNA及蛋白水平表达明显增加;尾侧型同源转录因子2的过表达明显激活了绒毛蛋白与LI-cadherin的表达;转染后细胞可出现肠细胞样特征改变。结果提示体外尾侧型同源转录因子2过表达可使膀胱上皮细胞发生尾侧型同源转录因子2激活并产生肠上皮分化,从而诱导腺性膀胱炎发生。