锰对神经细胞内质网应激信号分子的影响

目的 观察锰对大鼠脑片神经细胞内质网应激信号分子的影响及其与细胞凋亡的关系. 方法 以胎大鼠脑片为模型,用400μmo/L锰分别处理脑片612、18、24 h后,检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量,神经细胞凋亡率以及脑片中GRP78、CHOP及caspase 12的表达. 结果 随着锰处理时间的增加,脑片细胞损伤明显,LDH释放量,细胞凋亡率和GRP78、CHOP及caspase 12的表达均逐渐上升. 结论 锰可以时间依赖性地活化内质网应激信号分子,促使细胞凋亡.     

锰致神经细胞损伤中诱导型一氧化氮合酶及其基因的变化

[目的]观察不同浓度锰对大鼠脑片神经细胞的损伤情况,探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在锰诱导神经细胞损伤中的变化. [方法]培养出生后4～7 d大鼠脑片,培养液为50％高糖杜尔伯科改良伊格尔培养基,25％Hank平衡盐溶液,24％热灭活马血清,1％青霉素和链霉素.待第15天脑片神经细胞生长状态最佳时加入0、25、100、400 μmol/L MnC12.培养24h后,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,脑片细胞悬液中细胞凋亡率、一氧化氮生成量和iNOS活性,mRNA和蛋白表达水平. [结果]不同浓度锰处理脑片24h后,脑组织切片神经细胞发生明显损伤.随着锰处理浓度升高,LDH活性升高,100和400 μmol/L锰处理组是对照组的1.71、2.76倍.细胞凋亡率和一氧化氮生成量升高增加,25、100和400 μmol/L锰处理组分别是对照组的3.31、4.50和6.97倍和1.98、2.79和4.02倍.iNOS活性增强,100和400 μmol/L锰处理组分别是对照组的2.12和2.64倍.iNOS mRNA和蛋白表达水平明显升高,25、100和400 μmol/L锰处理组iNOS mRNA表达水平是对照组的1.27、1.43和1.86倍.100和400 μmol/L锰处理组iNOS蛋白表达水平分别是对照组的4.17和5.50倍. [结论]锰可致大鼠脑片神经细胞一氧化氮生成量和iNOS表达升高,进一步导致细胞凋亡率增加.     

锰对新生大鼠神经细胞凋亡及葡萄糖调节蛋白78和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响

目的 研究不同浓度锰对大鼠神经细胞凋亡及内质网应激信号分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)mRNA与蛋白以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(caspase-12)蛋白表达的影响.方法 以出生4～7 d的SPF级Wistar大鼠脑片为模型,分别用0(对照)、25、100、400 μmol/L锰暴露24h.检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,神经细胞凋亡率以及神经细胞内GRP78、CHOP mRNA和蛋白及caspase-12蛋白的表达.结果 与对照组比较,100和400 μ,mol/L锰暴露组培养液中LDH的释放量均较高,而各浓度锰暴露组大鼠神经细胞凋亡率均较高,差异有统计学意义(P＜O.01);且随着锰暴露浓度的升高,培养液中LDH的释放量和大鼠神经细胞凋亡率均呈逐渐升高的趋势.与对照组比较,100和400 μmol/L锰暴露组神经细胞内GRP78mRNA及各浓度锰暴露组大鼠神经细胞内CHOP mRNA的表达均较高,而100、400 μmol/L锰暴露组神经细胞内GRP78和CHOP蛋白及各浓度锰暴露组大鼠神经细胞内caspase-12蛋白的表达也均较高,差异有统计学意义(P＜0.01);且随着锰暴露浓度的升高,大鼠神经细胞内GRP78、CHOP mRNA和蛋白及caspase-12蛋白的表达均呈逐渐升高的趋势.结论 锰可促使大鼠神经细胞凋亡及GRP78和CHOP表达升高.     

MK-801对锰致神经元损伤的保护作用

[目的]研究不同浓度锰对原代培养神经元的损伤情况,同时用MK-801预处理,观察其对锰致神经元损伤的保护作用。[方法]选用原代培养神经元为模型,待细胞生长至最佳状态时,予以分组处理。染锰组为含不同浓度氯化锰25、100、400μmol/L的培养液,MK-801预处理组,用10μmol/LMK-801预处理30min后,再用400μmol/L氯化锰处理神经元,对照组为正常培养液,通过检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放量以及用TUNEL技术检测细胞凋亡的方法,评价MK-801对锰致神经元损伤的保护作用。[结果]用不同剂量锰处理神经元6～48h发现,神经元胞体固缩,突起断裂,网络消失。细胞活力和LDH释放量在同一染毒时间,随锰浓度升高细胞活力逐渐降低,LDH释放量逐渐升高;在同一锰浓度处理神经元,随着时间的延长细胞活力逐渐降低,LDH释放量逐渐升高。随锰浓度的升高,神经元细胞凋亡率和积分光密度均逐渐上升。用MK-801预处理30min后,400μmol/L锰处理神经元发现,与单纯用400μmol/L锰处理比较,细胞活力回升,LDH释放量降低,细胞凋亡率和积分光密度均有所下降。[结论]锰可以剂量依赖性和时间依赖性的对神经元造成损伤,促使细胞凋亡;MK-801可以在一定程度上有效地保护神经元。     

α-突触核蛋白在锰诱导神经细胞内质网应激中的作用

目的探讨α-突触核蛋白(α-Syn)在锰诱导神经细胞内质网应激中的作用。方法将野生型和α-Syn基因敲除(α-Syn~(-/-))型C57小鼠各24只,均随机分成4组(每组6只),即对照组(腹腔注射0.9%氯化钠)和低、中、高剂量染锰组(分别腹腔注射50、100和200μmol/kg氯化锰),注射容量为5 ml/kg,每周5次,共4周。而后处死小鼠,切取脑纹状体组织,检测锰含量、细胞凋亡率以及内质网应激和细胞凋亡相关信号分子表达情况。结果随着锰暴露剂量的增加,野生型和α-Syn~(-/-)型小鼠纹状体锰含量及细胞凋亡率均不断升高;高剂量染锰组α-Syn~(-/-)型小鼠细胞凋亡率明显高于野生型小鼠;与对照组比较,中、高剂量染锰组野生型小鼠PERK和eIF2α的磷酸化水平均明显升高,ATF4基因和蛋白表达均明显升高,IRE1磷酸化水平明显升高;中、高剂量染锰组,α-Syn~(-/-)型小鼠PERK和eIF2α蛋白表达升高,而磷酸化水平相对下降,IRE1磷酸化水平明显升高;高剂量组的总XBP-1及割裂的XBP-1基因表达升高,ATF6蛋白表达升高,野生型和α-Syn~(-/-)型小鼠CHOP和割裂的Caspase12蛋白表达均明显高于对照组,细胞凋亡率、IRE1磷酸化水平、CHOP和割裂的Caspase12蛋白表达则均明显高于野生型。结论α-Syn与锰诱导内质网应激PERK-eIF2α信号通路的活化有关,而且α-Syn对锰诱导的细胞凋亡在一定程度上有保护作用。     

大鼠经脑内注射染锰后iNOS表达的变化

目的观察大鼠经脑内注射染锰后诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的变化。方法健康雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,采用脑内注射方法染锰,于损伤后不同时间点取材,用免疫组织化学染色方法检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的变化;用免疫组织化学染色和Western blot检测诱导型一氧化氮合酶表达的变化。结果①实验组大鼠染锰后1d,iNOS无明显表达;注射侧黑质与对侧相比,TH免疫反应阳性细胞无明显变化。②实验组大鼠染锰后7d,iNOS免疫反应阳性细胞明显增加;注射侧黑质与对侧相比,TH免疫反应阳性细胞明显减少。③对照组大鼠脑内注射后7d和1d,iNOS均无表达;注射侧黑质与对侧相比,TH免疫反应阳性细胞无明显变化。结论锰中毒可导致多巴胺能神经元的损伤,诱导型一氧化氮合酶可能在其中发挥重要的作用。     

双酚A对原代培养胎鼠脑多巴胺神经元的氧化损伤作用研究

目的探讨双酚A对原代培养的胎鼠脑多巴胺神经元的毒性作用及损伤机制。方法孕14~15天SD胎鼠中脑多巴胺神经元在无血清条件下分别培养4或7天后,分别加入1、10、25、50、100μmol/L双酚A,于24h和48h后检测细胞内活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA);流式细胞术检测细胞凋亡;酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化用于鉴定和计数多巴胺神经元比例的变化。结果与对照组相比,各处理组均可导致细胞内活性氧升高,双酚A≥50μmol/L时,可无选择地使细胞内活性1氧明显升高,同时使SOD、GSH水平明显降低,MDA水平明显升高;双酚A浓度≥50μmol/L时可使凋亡细胞数显著增加。酪氨酸羟化酶阳性细胞数在25μmol/L以上时随双酚A浓度增加其比例显著降低。结论双酚A可通过氧化损伤导致体外培养的多巴胺神经元凋亡。     

姜黄素对STS诱导大鼠海马神经元损伤影响

目的 探讨姜黄素对星形孢菌素(STS)诱导的大鼠海马神经元损伤的保护作用。方法 运用乳鼠海马神经元原代培养细胞,采用STS诱导建立神经细胞损伤模型,实验设4组,对照组、模型组、姜黄素组(20 μmol/L)和姜黄素预处理组(姜黄素和STS分别为20 μmol/L),镜下观察神经细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)法测定细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)释放率检测细胞毒性,免疫荧光染色法检测活性氧(ROS)水平;western blot检测细胞中active caspase-3、p-AKT蛋白表达。结果 与模型组比较,姜黄素预处理组神经细胞损伤程度明显减轻;姜黄素预处理组细胞活性(0.877±0.016)较模型组(0.625±0.007)升高(t=3.47,P<0.01),LDH释放量(0.383±0.025)低于模型组(0.582±0.051)(t=3.25,P<0.01);模型组ROS阳性细胞数多于姜黄素预处理组;姜黄素预处理组active caspase-3表达量(0.951±0.089)低于模型组(1.370±0.131)(t=3.64,P<0.01),p-AKT表达量(1.107±0.025)高于模型组(0.611±0.002)(t=5.85,P<0.01)。结论 姜黄素通过抑制细胞ROS释放、下调active caspase-3和上调p-AKT蛋白表达发挥对STS所致大鼠海马神经元损伤的保护作用。     

MPTP对多巴胺能神经细胞凋亡的影响

本就神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)对多巴胺能神经细胞凋亡的影响进行综述，重点从MPTP损害细胞线粒体、促进细胞氧化应激、影响细胞信号转导、促进神经胶质细胞激活以及损害多巴胺转运体等方面介绍和总结了近年来在MPTP诱导多巴胺能神经细胞凋亡的机制尤其是细胞信号转导改变方面的研究进展；并对从细胞凋亡角度阐释帕金森病的发病机制以及MPTP多巴胺能神经毒性研究的进一步发展提出了展望。     

长春市冬季大气PM2.5对RAW264.7细胞毒性机制研究

目的研究长春市冬季大气PM_(2.5)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)的毒性作用。方法采用2016年11月16日至2017年3月18日期间基于空气质量指数的五级及以上雾霾天气采集的长春市大气PM_(2.5)对RAW264.7细胞进行体外染毒,终浓度分别为0、50、100、200、400μg/ml。以四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力,用酶标仪测定胞内活性氧(ROS)、乳酸脱氢酶(LDH)释放量及Ca~(2+)浓度,并用流式细胞仪测定细胞凋亡率,用ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量。结果 PM_(2.5)染毒浓度为100、200、400μg/ml时,RAW264.7细胞存活率明显低于对照组,LDH、ROS水平和Ca~(2+)浓度明显高于对照组,TNF-α和IL-6含量明显高于对照组,细胞凋亡率亦随染毒浓度的增加而升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论长春市冬季重污染大气PM_(2.5)可使RAW264.7细胞产生炎症损伤和氧化应激,进而引起细胞凋亡。     

大鼠生后锰接触对黑质多巴胺能神经元发育的毒性影响

目的　研究大鼠出生后锰接触对黑质多巴胺 (DA)神经元发育的毒性影响。方法　采用Morris水迷宫试验检测仔鼠的肌力变化 ;荧光分光度计法检测仔鼠尾状核脑匀浆DA含量的变化 ;酪氨酸氢氧化酶(TH)免疫细胞化学 (ABC法 )与图象分析相结合法检测黑质DA神经元和尾状核DA纤维的免疫反应强度和平均相对密度。结果　 (1)随着染锰浓度的增高 ,仔鼠的肌力呈现明显的衰退 ;(2 )尾状核脑匀浆的DA含量 ,随染锰浓度的升高而降低 ;(3)黑质TH免疫反应阳性神经元和尾状核TH免疫反应阳性纤维的反应强度、以及相应的TH阳性产物的平均相对密度 ,均随着染锰浓度的升高而显著下降。结论　大鼠生后锰接触 ,对黑质多巴胺神经元的发育有明显的毒性损害 ,其损害程度随染锰的剂量升高而增加     

氯化镧对原代大鼠星形胶质细胞凋亡和细胞周期的影响

目的研究不同浓度的氯化镧对原代大鼠星形胶质细胞凋亡和细胞周期的影响,探讨氯化镧所致神经损伤的机制。方法取新生大鼠大脑皮质进行原代星形胶质细胞分离和培养。在纯化及鉴定细胞后,用0,0.25,0.5,1.0 mmol/L氯化镧(LaC l3)处理24 h后,应用MTT法检测细胞活力,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放,应用倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪法检测细胞凋亡和细胞周期。结果随着LaC l3暴露浓度的增加,细胞活力明显降低,LDH释放明显增加,细胞形态出现不同程度的损伤,细胞凋亡率从0.72%上升至11.6%(P<0.05),G1期细胞指数从78.35%上升至92.11%(P<0.05),S期细胞指数从6.19%下降至1.53%(P<0.05),G2期细胞指数从15%下降至7.09%(P<0.05),均呈现剂量-效应关系。结论氯化镧可诱发原代大鼠星形胶质细胞凋亡,改变细胞周期,从而产生神经毒性。 更多还原     

醋酸铅对小鼠星形胶质细胞的凋亡作用

目的探讨醋酸铅对小鼠星形胶质细胞的凋亡作用,为进一步研究铅对血—脑屏障的损伤提供理论基础。方法用不同浓度醋酸铅(0、5、10、20、40μmol/L)染毒对数生长期小鼠星形胶质细胞C8(6、12、24、48 h)后,MTT法检测细胞生长情况;倒置相差显微镜观察细胞形态;分光光度计检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、丙二醛(MDA)含量,了解细胞损伤程度;免疫组化检测P53、Bax、Bcl-2的表达;PI-Hoechst33342染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果不同浓度醋酸铅染毒不同时间,各染毒组细胞生长活力较对照组明显降低(P0.01),并存在浓度与时间依赖关系;醋酸铅(5、10μmol/L)染毒24 h组,形态学观察细胞密度较对照组降低,突触缩短变细,细胞间连接减少;培养上清液中染毒组LDH、MDA含量较对照组明显升高(P0.01),P53、Bax表达上升,Bcl-2表达降低;PI-Hoechst33342双重染色和流式细胞仪检测显示,染毒组细胞凋亡率较对照组明显升高。结论醋酸铅可明显抑制小鼠星形胶质细胞生长,并通过Bax/Bcl-2比值升高促使凋亡,进而影响血—脑屏障。     

H_2O_2诱导大鼠原代海马神经细胞建立氧化损伤细胞模型

目的以H2O2诱导大鼠原代海马神经细胞建立氧化损伤细胞模型。方法取新生大鼠海马神经细胞,培养至第5天,加入终浓度为50、100、150、200和250μmol/L的H2O2,培养12、24和48 h后,观察细胞形态,通过MTT法测定细胞存活率,CCK-8法测定细胞损伤率,LDH酶标法测定上清液LDH活性,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,确定出细胞损伤的最佳浓度时间。结果 H2O2可诱导神经细胞损伤且呈时间浓度依赖性。150μmol/L H2O2作用24 h时,MTT法测得细胞存活率为(70.18±4.66)%;CCK-8法测得细胞损伤率为(28.30±6.72)%;LDH酶标法测得LDH活性为(208.81±12.24)U/L;流式细胞术测得细胞早期凋亡率为(11.53±2.53)%,晚期凋亡率及坏死率为(13.75±2.22)%。结论 150μmol/L的H2O2作用24 h,可成功构建海马神经细胞氧化损伤模型。     

UCH-L1对急性低压低氧小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平的调控作用

目的探讨急性低压低氧条件下UCH-L1基因敲除对小鼠海马中α-突触核蛋白(α-Syn)表达水平的影响及其机制,为治疗α-Syn蛋白相关的神经系统疾病提供依据。方法采用UCH-L1基因杂合子(UCH-L1~(+/-))小鼠雌雄交配的方式获得UCH-L1基因敲除纯合子(UCHL1~(-/-))小鼠和野生型小鼠(UCH-L1~(+/+)),PCR法鉴定小鼠的基因型。将UCH-L1~(+/+)小鼠和UCH-L1~(-/-)小鼠放入低压氧舱模拟海拔8000 m高度,持续低氧8 h,建立急性低压低氧模型。采用Western Blot法检测小鼠海马中UCH-L1、α-突触核蛋白及LC3蛋白表达水平的变化,观察UCH-L1基因敲除对α-突触核蛋白表达水平及其相关细胞自噬降解通路的影响。结果与对照组(0.702±0.121)相比,急性低压低氧可诱导野生型小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(1.310±0.096)显著升高(P0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ的比值轻度升高,而对UCH-L1蛋白的表达水平没有影响。当敲除UCH-L1基因的小鼠经急性低压低氧处理后,小鼠海马中α-突触核蛋白表达水平(0.952±0.093)明显低于野生型对照组(1.490±0.074)(P0.05),同时LC3Ⅱ/Ⅰ的比值也显著升高(P0.05)。结论UCH-L1基因敲除降低了急性低压低氧诱导的α-突触核蛋白表达水平升高,其机制之一可能与小鼠在急性低压低氧时因敲除UCH-L1基因而进一步促进细胞自噬通路的活化有关。     

锰对神经元细胞内SNARE复合物蛋白及突触囊泡的影响

目的研究锰干扰神经递质释放的分子机制,重点观察锰对神经元细胞内SNARE复合物蛋白及突触囊泡的影响。方法利用体外培养的神经元,用0~400μmol/L锰处理24 h后,观察细胞活力及培养液中LDH的释放量。根据结果挑选剂量为0、12.5、50、200μmol/L的氯化锰处理神经元24 h,测定SNARE复合物相关蛋白的基因及蛋白表达,以及活动性突触囊泡的数量。结果随着锰处理浓度的增加,神经元损伤逐渐加重;与对照组比较,Syntaxin1A的基因及蛋白表达均未见明显改变,SNAP 25的基因和蛋白表达均逐渐下降,VAMP 2的基因和蛋白表达均逐渐升高,进而导致SNARE复合物蛋白形成下降,同时活动性突触囊泡的数量明显减少。结论锰通过干扰SNARE复合物相关蛋白的表达,减少了神经元细胞内SNARE复合物蛋白的形成,进而导致活动性突触囊泡减少,造成神经递质释放紊乱。     

α-突触核蛋白与帕金森病

α-突触核蛋白是一种中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,与帕金森病的发病有密切的关系.α-突触核蛋白在各种生理,环境因素的影响下异常表达和聚集,通过一系列的氧化应激等生化反应,产生了对神经元的毒性作用,从而参与了帕金森病的发生.对α-突触核蛋白的化学性质,聚集的机制及其影响因素的了解与研究,将会十分有利于帕金森病的预防和治疗.     

不同价态锰对多巴胺能神经细胞凋亡作用的影响

为探讨不同价态锰对细胞凋亡的影响 ,选用多巴胺能神经细胞 (SH SY5Y细胞 )作为锰神经毒作用的体外测试体系 ,研究二价锰 (Mn2 + )和三价锰 (Mn3+ )对SH SY5Y细胞凋亡的诱导作用以及对多巴胺 (DA)含量的影响。结果显示 :MTT法检测细胞损伤的程度 ,显示Mn2 + 和Mn3+ 呈时间和剂量依赖性的损伤SH SY5Y细胞 ;流式细胞技术证实Mn2 + 和Mn3+ (0 5～ 2mmol L)与SH SY5Y细胞接触 2 4～ 72h ,可诱导细胞发生凋亡 ,透射电镜技术发现凋亡细胞出现核染色体凝集。用高效液相色谱仪测定发现DA含量降低。说明锰所致神经细胞死亡方式是以凋亡为主 ;不同价态锰可引起细胞自身合成的DA含量下降 ,但Mn3+ 的毒作用高于Mn2 + 的毒作用     

甲苯对原代培养海马神经细胞的毒性研究

目的　通过在体外对原代培养的海马神经细胞进行染毒 ,观察其对神经细胞的毒作用 ,并探讨其作用机制。方法　取新生的SD大鼠海马神经细胞进行原代培养 ,两周后 ,用甲苯染毒 ,分成 3个染毒组 ,染毒浓度分别为 3、6和 9mmol L ,并设空白对照组和赋形剂组 ,染毒 2 4h ,观察其对细胞形态、细胞存活率、LDH漏出率、细胞内游离钙和细胞凋亡的影响。结果　甲苯染毒后 ,细胞的形态发生改变 ,引起细胞突起萎缩 ,细胞肿胀变圆 ,细胞数量减少 ;神经细胞存活率的显著下降 ,且随着染毒时间的延长及浓度的升高其存活率逐渐降低 ;高剂量组神经细胞LDH漏出率的显著升高 ,与对照组相比有显著性 (P <0 0 5 ) ;细胞细胞内的[Ca2 + ]i浓度显著上升 ,与对照组相比P <0 0 5 ,并呈剂量依赖性的变化 ,加入钙通道拮抗剂硫氮卓酮后 ,则未见 [Ca2 + ]i浓度上升 ;可见明显的细胞凋亡。结论　甲苯体外染毒对神经细胞有较强的毒性。这可能与甲苯有较强的脂溶性、引起细胞钙内流增加 ,促进细胞凋亡有关。     

TNFα通过非神经钙调蛋白途径介导皮层神经细胞损伤

目的：探讨在TNFa诱导的脑皮层神经细胞损伤机制中神经钙调蛋白的作用。方法：用TNFn诱导原代培养的胎鼠皮层神经细胞损伤;通过MTT法、LDH释放率测定观察细胞生存力和损伤程度;通过膜联蛋白（Annexinv）和碘化丙啶（PI）免疫荧光法观察细胞凋亡或坏死程度。结果：MTT和LDH释放率测定结果表明．TNFa可引起神经细胞的生存力明显下降,并呈量艘、时效依赖关系。TNFd与CsA联合应用组,皮层神经元的生存力则提高不明显,无统计学意义。AnnexinV和PI免疫荧光检测表明,CsA不能减轻TNFa诱导的神经细胞的凋亡和坏死。结论：神经钙调蛋白途径在TNFa引起皮质神经元损伤并不起主要作用。说明TNFa可通过非神经钙调蛋白途径引起神经元损伤。