恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。     

用无细胞蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白的研究

目的探索无细胞麦芽体外蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白可行性,并检测用重组蛋白制备的免疫血清对原虫蛋白的特异性反应。方法将目的蛋白PfRON2的部分片断克隆连接到重组表达载体后,用无细胞麦芽体外蛋白合成系统进行重组表达并纯化,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫斑点实验(Western blot)和免疫荧光抗体实验(IFA)检测该血清对恶性疟蛋白的特异性反应。结果成功克隆的重组质粒能在无细胞麦芽体外蛋白合成系统中生成大小相符的GST融合蛋白,并能较好地纯化。免疫斑点实验中,用该重组蛋白制备的免疫血清能检测到重组蛋白和恶性疟目标蛋白,免疫荧光抗体实验显示该免疫血清能成功地标记恶性疟目标蛋白所在部位。结论无细胞麦芽体外蛋白合成系统可应用于恶性疟原虫蛋白的重组表达,获得的免疫血清能特异性识别疟原虫蛋白。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

四膜虫细胞表达恶性疟原虫环子孢子蛋白并定位于细胞表面

异种表达是鉴定蛋白功能、研究其结构和抗原产生的重要工具。疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)是子孢子表达的一个糖基磷酯酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)锚定的表面蛋白，在蚊和脊椎动物宿主体内都发挥了重要作用，也是疟疾疫苗的一个重要候选分子。由于疟原虫基因组中含有极其丰富的AT含量，对有效表达是个障碍，Peterson利用基因组中同样富含AT的营自生生活四膜虫作为编码恶性疟原虫CSP的表达细胞。     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的　为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７）,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法　将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １,形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果　成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７,转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ）,纯化后纯度达７２％ ,ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论　成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白,为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７ 打下基础     

恶性疟原虫FCC1／NH株裂殖子表面蛋白MSP1第2—5区基因的PCR扩增及克隆

构建恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1基因2～5编码区真核表达质粒pcDNA3／MSP1，为FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。方法采用PCR技术对恶性疟原虫海南分离株（FCC1／HN）基因组DNAMSP1第2～5区基因片段进行扩增．扩增产物经纯化后用Xhol和Aaal双酶切然后定向克隆入pcDNA3质粒，转化大肠杆菌TG1．再用相同内切酶酶切和PCR扩增对重组子进行鉴定。结果筛选出编码FCC1／HN株MSP1第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1。结论编码FCC1／HN株MSPI第2～5区基因片段的真核表达质粒pcDNA3／MSP1的构建，为恶性疟原虫FCC1／HN株MSP1的体外表达及其基因工程疫苗的研制奠定基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面抗原2基因片段的克隆及表达

目的构建恶性疟原虫海南分离株(FCC-1/HN)裂殖子表面抗原2(MSA2)基因片段的重组真核表达质粒pBK/MSA2.方法采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pBCG/MSA2中分离出经过测序鉴定的MSA2基因片段,将其亚克隆入真核表达载体pBK-CMV,构建重组真核表达质粒pBK/MSA2.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5a中进行表达,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析.结果从pBCG/MSA2中分离出MSA2基因片段,成功构建pBK/MSA2重组质粒;SDS-PAGE及Western-blot分析结果显示,特异性蛋白条带的分子质量约为31 ku.结论恶性疟原虫MSA2可在大肠杆菌中成功表达.     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的 为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白２（ＨＲＰ２）应用于疟疾诊断和疫苗研究,本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的ＨＲＰ２。方法 将ＨＲＰ２基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２;诱导ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２转化的ＢＬ２１菌,纯化表达产物并免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠;以免疫色谱法鉴定表达产物,以免疫小鼠血清对受染红细胞（ＩＲＢＣ）进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 成功构建了ｐＧＥ     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫PFC0460w基因片段的克隆与生物信息学分析

用逆转录PCR方法从恶性疟原虫3D7株红内期RNA扩增PFCO460w基因片段,克隆于pGEM-T easy载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选阳性克隆,PCR鉴定、测序并作序列分析。结果显示,从恶性疟原虫3D7株中扩增到3种PFCO460w片段序列,分别为618、597和543 bp,其中618 bp的片段序列与PlasmoDB数据库中的已知序列完全一致（GenBank登录号为XM₀01351147）。597 bp和543 bp片段序列已登录GenBank数据库,登录号分别为JF799872和JF799873。618 bp片段编码205个氨基酸,经Robbeta服务器结构预测,其编码的蛋白质可能有5种三维结构。     

恶性疟原虫的基因表达控制

由疟原虫感染引起的疟疾是一种严重危害人体健康的寄生虫病,在发展中国家造成巨大的经济损失.恶性疟原虫基因组测序的完成,使实验室可以更进一步研究恶性疟原虫的基本生物学过程,其中恶性疟原虫基因表达调控受到重视.严格的基因表达模式控制着疟原虫的分化,随着一些假定转录因子的鉴定,恶性疟原虫的基因表达调节机制可能与真核生物不一样.该文对恶性疟原虫基因调节的最新研究进展进行了综述.     

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端片段在毕赤酵母表达系统的高效表达与纯化(英文)

目的利用毕赤酵母表达系统高效表达并获得纯度较为理想的恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端片段(MSP-119)重组蛋白。方法将带有6-his基因的MSP-119基因序列插入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k中,用高压电穿孔转化法将目的基因转化入酵母感受态细胞GS115,筛选出高拷贝转化子,优化表达条件,利用甲醇进行诱导表达。表达产物用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测。结果毕赤酵母分泌表达MSP-119蛋白,免疫印迹结果表明MSP-119基因表达蛋白能被抗MSP-119的单抗所识别,出现特异条带,将培养上清利用Ni-NTA柱纯化后,推算MSP-119蛋白的表达量为1.0g/L。结论酵母细胞表达系统可高效表达可免疫识别的MSP-119重组蛋白。     

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列,了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段,并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体,用双脱氧链末端终止法进行测序,应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异,３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ,核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2融合HBS基因重组质粒的免疫原性研究

目的　构建恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)裂殖子表面蛋白 2 (MSP2 )融合HBsAg基因片断真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ,观察该DNA疫苗的免疫特性。方法　 (1)以恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)基因组为模板 ,扩增出pfMSP2 DNA片断 ,将该片段克隆入质粒pVXORF1-HBS中HBS的上游并与之紧密相连 ,构建质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ;构建真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 以作为对照。 (2 )用上述构建的质粒及空质粒 pVXORF1免疫KM小鼠 ,以ELISA检测血清IgG抗体。 结果　 (1)筛选出的重组子为编码FCC1/HNMSP2 基因片断的重组质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS及 pVXORF1-PfMSP2 。 (2 )裸DNA尾根多点注射KM小鼠 ,显示 pVXORF1-PfMSP2 -HBS组小鼠较pVXORF1-PfMSP2 组小鼠产生抗PfMSP2 蛋白的抗体效价明显增高 ,二者比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。结论　PfMSP2 融合HBsAg基因片段激发机体产生抗PfMSP2 抗体的能力显著增强 ,提示PfMSP2 融合HBsAg基因有可能作为高效抗红内期恶性疟原虫复合多价基因疫苗的有效组成部分     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。