帕金森病基因治疗的理论:VMAT2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应.方法从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定.重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化.结果RT-PCR扩增到1 637 bp的带有Kozak序列的cDNA片段.原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)vMAT2免疫着色明显高于对照组.HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P＜0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P＜0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1 176.8±82.5)%(P＜0.01).结论克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达.该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗.     

帕金森病与Ⅱ型囊泡单胺转运体的相关性

帕金森病是一种中老年人常见的慢性进行性神经系统退行性疾病，其主要病理变化是黑质致密部多巴胺能神经元进行性死亡、残存神经元多巴胺合成能力降低，导致锥体外系运动调节功能减弱。中脑纹状体多巴胺含量的降低程度与多巴胺能神经元数目的减少程度相一致。突触前膜重摄取是多巴胺生理效应中止的主要方式，而多巴胺转运体是实现该生理功能的物质基础。进入突触前膜胞质的多巴胺，再经囊泡膜上的Ⅱ型囊泡单胺转运体转运至囊泡内，以待重新利用。国内外的许多研究表明帕金森病多巴胺能神经元的选择性缺失源于多巴胺自身氧化的内源性毒性。在突触前膜重摄取多巴胺的过程中，多巴胺转运体和Ⅱ型囊泡单胺转运体发挥转运递质和隐匿毒性物质的双重作用，有望成为帕金森病治疗的药物新靶标，并对传统的左旋多巴治疗方案提出了质疑。     

转染VMAT2基因的中国仓鼠卵巢细胞对毒物抵抗作用的研究

目的:研究毒物鱼藤酮和1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对野生型及转染囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的毒性作用。方法:将不同浓度的MPP+、鱼藤酮与野生型CHO细胞(WT-CHO)和转染VMAT2基因的CHO细胞(VMAT2-CHO)共同培养,采用细胞MTT比色法和形态学观察,探讨毒物对细胞的毒性作用,通过激光共聚焦显微镜观察毒物对2种细胞的细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响。结果:VMAT2-CHO在一定时间(72 h)内对MPP+(0.2-2.0 mmol/L)和鱼藤酮(0.05-1.0μmol/L)的毒性有抵抗作用(P<0.05)。结论:VMAT2可以抵抗一定浓度的MPP+和鱼藤酮引起的神经细胞毒性作用。     

高密度脂蛋白对HepG2细胞代谢综合征相关新基因MSRG表达的影响

目的:观察高密度脂蛋白对HepG2细胞代谢综合征相关新基因MSRG表达的影响。方法:实验于2006-03/10在四川大学华西基础医学与法医学院医学分子生物学省级重点开放实验室完成。设计MSRG引物及Taqman探针,构建标准质粒,建立RealtimePCR定量检测MSRG表达的方法。以含5%无脂蛋白血清的低糖DMEM培养基培养HepG2细胞,分别加入不同浓度的高密度脂蛋白(0,25,50,100,200mg/L)孵育24h;以含100mg/L高密度脂蛋白的5%LPDS低糖DMEM培养基孵育HepG2细胞不同时间(0,6,12,24,36h),分别以0mg/L及0h为对照,通过RealtimePCR检测MSRG的表达。结果:①不同浓度高密度脂蛋白孵育细胞时,在0～100mg/L范围,MSRG表达随高密度脂蛋白浓度的增加有下降趋势;与0mg/L组相比,MSRG在50,100mg/L组表达差异具有显著性意义(P<0.05);与100mg/L组相比,高密度脂蛋白200mg/L组基因表达有所回升,但差异无显著性意义(P>0.05)。②不同高密度脂蛋白孵育时间0～24h组,MSRG表达随时间延长有下降趋势;与0h相比,12,24,36h组基因表达降低(P<0.05),24h组MSRG表达最低;与24h组相比,MSRG在高密度脂蛋白孵育36h组表达有所回升,但差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在低浓度(0～100mg/L)及短时间内(0～24h)高密度脂蛋白可以抑制HepG2细胞MSRG的表达。     

培高利特对早期帕金森病患者纹状体多巴胺能神经元自然变性率及其运动能力的影响：一项双盲、随机、平行、安慰剂对照实

目的：探讨培高利特对早期帕金森病患者纹状体多巴胺能神经元的影响以及改善患者肢体运动能力的作用。方法：选择2001-04／2001-12在上海长海医院神经内科帕金森病专病门诊就诊、未经抗帕金森病药物治疗、具有单侧肢体运动徐缓、震颤、强直、特殊姿势的早期帕金森病患者22例为研究对象；男14例，女8例；年龄55～70岁。所有患者均书面同意参加该试验，整个试验过程中能坚持服用单一药物治疗，未经同意不能改动治疗方案。将患者随机分为安慰剂组11例和培高利特组11例。安慰剂组给予苯海索治疗，培高利特组给予培高利特治疗。苯海索、培高利特起始日剂量均为0．05mg。入组第l周时，每日服用1次；以后每周增加1粒，经过1个月左右达到日剂量0．25mg，此后维持剂量恒定(该剂量苯海索抗帕金森病作用不明显，故安慰剂组可称为帕金森病自然变性组)。①观察两组治疗前及治疗后13个月纹状体^99Tc^m-2β-[N’双(2-硫乙基)乙撑二胺基]甲基，3β-(4氯苯基)托烷单光子发射计算机断层扫描特异性摄取值百分率的变化，评估纹状体多巴胺神经元的变性数量。②观察治疗前，治疗后6，13个月时帕金森病评定量表变化，评估培高利特对肢体运动功能障碍的改善作用。结果：最终进入结果分析的帕金森病患者22例。①治疗13个月后，安慰剂组和培高利特组患者起病肢体对侧纹状体^99Tc^m-2β-[N’双(2-硫乙基)乙撑二胺基]甲基，3β-(4氯苯基)托烷特异性摄取下降值百分率分别为(31．8&;#177;15．6)％，(33．8&;#177;17．2)％，两组比较，无明显差异(P&;gt;0．05)；起病肢体同侧纹状体^99Tc^m-2β-[N’双(2-硫乙基)乙撑二胺基]甲基，3β-(4氯苯基)托烷特异性摄取下降值百分率分别为(28．9&;#177;13．0)％，(34．4&;#177;18．1)％，两组比较，无明显差异(P&;gt;0．05)。②培高利特组治疗后6，13个月帕金森病评定量表评分[(13．0&;#177;6．0)，(10．O&;#177;5．9)分]明显低于安慰剂组评分[(23．7&;#177;4．3)，(27．0&;#177;4．3)分](t=4．69，5．87，P&;lt;0．01)。培高利特组治疗13个月时帕金森病评分量表评分明显低于治疗前(t=2．13，P&;lt;0．05)。结论：早期帕金森病患者经培高利特治疗13个月后，起病肢体同侧和对侧纹状体多巴胺能神经元的变性率与应用苯海索大致相同，说明培高利特治疗不增加该区域多巴胺能神经元的自然变性率；而培高利特治疗后帕金森病评定量表评分的下降表明该药具有提高早期帕金森病患者运动能力的作用。     

血管内皮细胞生长因子对K562细胞Angiopoietin-2基因及MMP-9表达的影响

血管生成素（Angiopoietin，Ang）是新近克隆的与血管生成有关的一个家族。Ang-2是其家族的一个成员，Tie-2为其受体。有研究表明，血管内皮细胞生长因子（VEGF）在Ang-2诱导的肿瘤性血管生成中发挥重要作用。而瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生金属蛋白酶（metalloproteinase，MMP）降解细胞外基质（ECM）、基底膜的能力密切相关。     

乙酰化肌细胞增强因子2D调节Nur77基因对T细胞凋亡的影响

目的:Nur77是介导T细胞凋亡的重要基因,它的激活需要第二信使钙离子,而Nur77基因启动子的钙反应元件是转录因子肌细胞增强因子2D的结合位点.探讨在Nur77诱导T细胞凋亡过程中肌细胞增强因子2D是否可以被乙酰化,以及通过调节Nur77基因乙酰化对T细胞凋亡的影响.方法:实验于2006-11/2007-09在吉林大学第一医院血液肿瘤科完成.①材料:大肠杆菌DH5α、pcDNA3质粒由吉林大学第一医院中心研究室保存.pET32M质粒、Flag-p300质粒、pSilencerTM-p300 RNAi质粒由香港科技大学Zhengguo Wu博士馈赠.NFATp质粒由哈佛大学Yun Chen博士馈赠.Jurkat细胞由吉林大学第一医院血液肿瘤科提供.②实验方法:PCR法产生全长的Nur77和依赖Nur77的荧光报告基因被亚克隆到pcDNA质粒中,产生的肌细胞增强因子2D(1-514)、(1-121)、(1-300)、(301-514)各片段以及含4个赖氨酸(K245/K250/K267/K279)位点突变为精氨酸位点的肌细胞增强因子2D (4KR)突变体亚克隆到pcDNA后在氨基端含有Flag抗原簇,于细菌表达载体上进行质粒构建,验证正确的质粒使用脂质体DMRIE-C进行转染.③实验评估:将Nur77荧光报告基因与肌细胞增强因子2D、p300、NFATp共转染到Jurkat细胞中,检测p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77转录的影响.免疫沉淀法检测内源性肌细胞增强因子2D是否能够被乙酰化,以及阻滞p300表达后是否影响其乙酰化.体外乙酰化法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化位点.荧光素报告分析法检测肌细胞增强因子2D的乙酰化功能缺失对Nur77转录活性的影响.采用流式细胞仪检测其功能缺陷对Nur77诱导T细胞凋亡的影响.结果:①肌细胞增强因子2D与NFATp的二聚体虽然不能促进Nur77的转录,但p300、NFAT、肌细胞增强因子2D的三聚体却能明显促进Nur77的转录,且p300与肌细胞增强因子2D的二聚体也明显促进Nur77的转录.②PMA/Iono活化钙信号传导通路后,肌细胞增强因子2D被乙酰化.当内源性p300RNAi后,p300的表达被阻滞时,肌细胞增强因子2D的乙酰化水平显著下降.③K245,K250,K267,K279氨基酸同时突变可以使肌细胞增强因子2D乙酰化程度大部分丧失,说明在体外这4个赖氨酸位点是肌细胞增强因子2D的主要乙酰化位点.④与空载体比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D可使Nur77转录功能提高2.48倍;与转染野生型的肌细胞增强因子2D比较,转染乙酰化缺陷的肌细胞增强因子2D能降低Nur77基因70.4%的转录功能.⑤与空载体比较,Nur77表达能够促进T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从4.3%提高至16.3%;共表达野生型肌细胞增强因子2D与Nur77能够进一步促进T细胞的凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%提高到31.0%;但肌细胞增强因子2D乙酰化功能缺失的突变体肌细胞增强因子2D明显降低Nur77介导的T细胞凋亡,早晚期凋亡之和从16.3%降低到9.2%.结论:p300对肌细胞增强因子2D促进Nur77的转录起主要作用.肌细胞增强因子2D在Nur77诱导的T细胞凋亡过程中可以被乙酰化,乙酰化的肌细胞增强因子2D通过上调Nur77基因的转录来促进T细胞凋亡.