赤灵芝中醇溶性蛋白提取工艺研究

目的研究不同工艺参数对赤灵芝醇溶性蛋白提取率的影响,为探索赤灵芝醇溶性蛋白的工业化生产提供参考。 方法以赤灵芝为原料,采用乙醇提取醇溶性蛋白,并通过单因素实验和正交实验研究浸提时间、温度、pH、液料比及提取次数对醇溶性蛋白提取率的影响,确定赤灵芝醇溶性蛋白提取的最佳工艺。 结果单因素实验结果表明,提取时间2b,料液比1：40,醇溶性蛋白含量最高。正交实验得出各因素对灵芝醇溶性蛋白提取率的影响程度大小依次为：pH值〉料液比〉提取温度〉乙醇浓度,醇溶性蛋白提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度60％,pH2．5,料液比1：40,提取温度60℃。 结论通过单因素实验和正交实验确定了赤灵芝醇溶性蛋白的最佳提取工艺参数,为赤灵芝醇溶性蛋白的工业化生产提供了参考依据。     

三种赤灵芝粉对免疫抑制模型小鼠免疫功能的调节作用

目的:为了探讨灵芝调节机体免疫功能的作用机制,并寻找出一种能有效改善机体免疫功能的灵芝制剂,本文研究了三种赤灵芝粉对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用。方法:实验动物随机分为5组(Ⅰ～Ⅴ组),Ⅱ～Ⅴ组采用腹腔注射环磷酰胺(CTX)70 mg.kg-1.bw-1,隔日注射,共4次,以制备动物模型,Ⅰ组注射等体积生理盐水。Ⅲ～Ⅴ组于注射CTX次日及末次注射CTX后11日内分别灌胃给予赤灵芝破壁孢子粉(D1)、赤灵芝孢子粉(D2)和赤灵芝精粉(D3)(1g.kg-1.bw-1),定期监测小鼠体重;给药后无菌取脾脏称重,计算脾指数;采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验检测巨噬细胞吞噬功能;采用NK细胞介导的细胞毒试验检测NK细胞功能;采用淋巴细胞转化试验检测T、B淋巴细胞功能;采用流式细胞术检测CD4+T及CD8+T细胞比例。结果:与免疫抑制组相比,小鼠给予灵芝粉后,三组小鼠体重均升高(P<0.05);D3组脾指数降低;D1和D2组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数较免疫抑制组升高(P<0.05);三组小鼠NK细胞杀伤活性无明显变化;脾脏T、B淋巴细胞增殖能力无明显变化;D3组小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞比例明显升高,特别是CD4+T细胞升高最为显著且较正常对照高(P<0.05)。结论:三种灵芝对免疫抑制模型小鼠的免疫功能具有调节作用,尤其是赤灵芝精粉具有显著提高CD4+T细胞数量的作用,为其临床应用提供了实验依据。     

北京市4例输入性黄热病病例病毒全基因组特征分析

目的 通过对2016年北京市4例输入性黄热病病毒全基因组深度测序分析,以期对病毒进行溯源、分析疫苗有效性以及防控策略提供分子依据.方法 将荧光PCR检测为阳性的血液、尿液样本利用Ion Torrent PGM平台进行全基因组深度测序,通过MEGA 6.0软件中邻接法进行遗传进化分析,并采用Lasergene Protean软件进行E蛋白氨基酸变异分析及抗原性分析.结果 从首例病人的血液样本和其他3个病例的尿液样本中分别获得了黄热病病毒的全基因组序列.遗传进化树分析结果表明,4例黄热病病毒基因组与安哥拉71株(AY968064)高度同源,相似度分别达99.21％、98.11％、98.02％、98.39％.4例黄热病病毒E蛋白的氨基酸序列与安哥拉71株的序列分析相似度分别达99.6％、99.39％、99.01％、99.59％.4例黄热病病毒E蛋白抗原性与17D疫苗株(X03700)的E蛋白抗原性比较分析无明差异.结论 4例黄热病病毒都是安哥拉流行株类似株,目前使用的17D疫苗具有有效性.     

氨基酸片增强小鼠免疫力的实验研究

目的：观察氨基酸片对小鼠的免疫功能的影响。方法：80只ICR小鼠随机分为对照组及低、中、高剂量组，分别连续灌胃给予溶剂及氨基酸片样品（剂量为0．4g·kg^-1、0．8g·kg^-1、2．4g·kg^-1）30d后，测定健康小鼠NK细胞活性、健康小鼠刀豆蛋白A（ConA）诱导的脾淋巴细胞转化能力、1％2，4二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠迟发性超敏反应（DTH）、1％DNFB致敏小鼠的脾指数及胸腺指数实验等免疫指标。结果：中剂量组及高剂量组氨基酸片能明显增强小鼠的脾淋巴细胞转化功能，高剂量组氨基酸片可减轻由1％（DNFB）溶液所致小鼠耳肿胀度。结论：氨基酸片能增强小鼠免疫力。     

灵芝多糖抗肿瘤靶向作用机制研究进展

灵芝在中国已有2000多年的药用历史, 大量的民间实践证明灵芝对多种疾病具有明显的疗效, 其主要药效成分为(ganoderma lucidum polysaccharides, GLP), GLP存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中, 由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等组成的混合物, 是灵芝的主要有效成分之一, 尤其GLP药理活性广泛;具有提高机体免疫功能、抗肿瘤等作用.     

北京地区2株人偏肺病毒的P和M蛋白基因序列分析

目的进一步了解北京地区人偏肺病毒(hMPV)编码基因的特征。方法从分属于hMPV的两个不同基因进化簇(即基因型)的2份临床标本BJ1816和BJ1887中扩增P和M全基因，克隆至pBS-T载体中并进行测序，与GenBank中的hMPV的基因序列进行比较分析和种系进化分析。结果经扩增BJ1816和BJ1887的P基因全长为885个核苷酸，编码294个氨基酸；M基因全长765个核苷酸，编码254个氨基酸。BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因与同一基因簇内的hMPV有相当高的氨基酸同源性(91．9％-100％)。BJ1816和BJ1887间P基因的氨基酸同源性仅为85．8％，而M基因的氨基酸同源性为96．9％。结论BJ1816和BJ1887的P和M蛋白基因特征与其他国外文献中所报道的hMPV相似，不同型的hMPV的P基因之间比M基因显示了更强的基因多样性。     

鸭α干扰素成熟蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

鸭Ⅰ型干扰素基因是在1995年由Schults等成功克隆的。基因总长度为1．2kb，其蛋白质由191个氨基酸组成，其中N末端的30个疏水氨基酸为信号肽，成熟多肽为161个氨基酸。本实验利用PCR技术从pMD-18-duIFN-α重组体上克隆出鸭α干扰素成熟蛋白基因(mDuIFN-α)，并用pET30a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中进行了高效表达。     

一种非T细胞性促有丝分裂素——猪苓多糖

传统中药猪苓(Polyporus umbella-tus)是一种真菌的菌核。从猪苓中提取的多糖(简称猪苓多糖)具有抑制肿瘤生长及增强荷瘤动物和肿瘤病人的某些免疫功能的作用,且无毒性~([1～4])。本文就猪苓多糖的     

细胞因子与氨基酸代谢关系的研究进展北大核心CSCD

机体免疫系统与物质代谢存在交互作用,作为蛋白质组成基本单位的氨基酸对于维持细胞生存十分重要,其代谢受细胞内外环境中多种因素(如细胞因子等)调控。研究表明部分氨基酸及其相关代谢物具有免疫调节功能,而来源于免疫细胞和组织细胞的细胞因子在感染、炎症性疾病等机体防御过程中亦能发挥免疫调节作用,但细胞因子与氨基酸代谢的联系尚不明确,本文将围绕细胞因子与氨基酸代谢的联系进行综述。     

北京地区2000-2004年分离的呼吸道合胞病毒B亚型株G蛋白基因的序列分析

目的 了解近年来北京地区流行的B亚型呼吸道合胞病毒（BSV）G蛋白的基因特征。方法 2000年冬季至2004年冬季自首都儿科研究所附属儿童医院收集的急性呼吸道感染患儿呼吸道标本，从中分离到B亚型RSV毒株，每年随机选取1至2株毒株，用RT-PCR扩增其G蛋白全基因后克隆至pBS-T载体中，筛选出阳性克隆后测序，并与B亚型标准株（CH18537）和文献报道的毒株序列进行比较分析。结果 所测毒株G蛋白全基因核苷酸长度分别为915、921和981bp，推导的氨基酸长度分别为292、293、312和315从。分离株与B亚型标准株CH18537间存在着明显的差异，CH18537株同分离株间的核苷酸的同源性为91．9％～93．7％，氨基酸的同源性只有85．0％～89．0％。分离株间核苷酸的同源性为93．4％～98．8％，氨基酸的同源性为88．2％～98．6％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端，而胞内区和跨膜区相对保守。此外，在进行G蛋白基因分析的8株B亚型分离毒株中，我们发现有3株BSVG蛋白在490～495位核苷酸缺失，3株RSVG蛋白在c末端791位后出现了60个核苷酸的插入，导致C末端259位后出现20个氨基酸的插入。这60个核苷酸与相邻的前60个核苷酸高度重复，只出现3至4个核苷酸的差异。该3株分离株与文献报道的有60个核苷酸插入的两株（S00-4和BA4128／99B）核苷酸和氨基酸同源性分别为97．5％～98．6％和95．5～98．1％，在插入的20个氨基酸中，有高达50％（9～10个氨基酸）左右的丝氨酸和苏氨酸氧连接的糖基化位点。结论 RSVB亚型G蛋白基因变异存在着多样性，分离株既有核苷酸替代，又有基因缺失和插入，还有糖基化位点的改变和氨基酸长度的改变。这种变异使G蛋白高度糖基化，提示最终可能导致病毒抗原性的改变。北京分离的有60个核苷酸插入的变异株与日本及西班牙报道的变异株有非常近的亲缘关系，提示这种G蛋白基因中有60个核苷酸插入的B亚型变异株已经在子代病毒中形成稳定遗传并在世界范围内传播。     

人巨细胞病毒PPUL44蛋白核定位信号结合多肽氨基酸序列分析

目的 寻找与人巨细胞病毒（HCMV）PPUL44蛋白核定位信号（NLS）具有较强能力的多肽,研究这些多肽的氨基酸序列特点。方法 采用合成的HCMV PPUL44 NLSA和NLSB分别在一个随机多肽文库中筛选出与NLS具有结合能力的克隆,用四色荧光自动测序的方法测定上述克隆的DNA序列,对这些克隆的多肽氨基酸序列进行同源性比较,并与蛋白质文库中已知蛋白的氨基酸序列进行比较。结果 与HCMV PPUL44 NLSA具有结合能力的多肽（bNLSApep)的氨基酸序列与细胞输入蛋白Importin α亚单位的氨基酸具有较高的同源序列,其中bNLSApep48氨基酸序列AVVTPVLTEILK与Importin α亚单位的Arm7区的第18至29氨基酸序列ANIFPVLTEILQ具有极高的相似性;bNLSBpep39氨基酸序列则与Imporin α亚单位的全部8个Am区的第10至21氨基酸的同源序列相似。结论 HCMV PPUL44 NISA可能是Importin α亚单位针对HCMV PPUL44蛋白的特异性识别位点,与Importin α亚单位Arm7区结合;而HCMV PPUL44 NLSB则为Importin α亚单位的非特异性识别位点。本研究结果提供了Importin α亚单位的Arm重复区是NLS结构结合区的实验证据。     

银耳,茯苓对小鼠免疫调节效应的观察

银耳、茯苓对小鼠免疫调节效应的观察林晓明，冯建英，龙珠，季晓莉银耳与获苓是药食两用真菌，在祖国医学中具有极高的药用价值。七十年代初，Ｈａｍｕｒｏ等就提出茯苓具有增强免疫和抗肿瘤作用，近年国内的研究也证实这一点。目前研究主要提取其多糖成份进行，从天然食...     

海洋无脊椎动物提取物免疫调节活性的初步研究

目的：为了从海洋无脊椎动物中寻找生物活性物质，对山东青岛及其附近海域常见的21种海洋无脊椎动物的粗提物进行了免疫调节活性测定。方法：测定了它们的乙醇提取物以及不同极性部位对T、B淋巴细胞增殖的调节作用。在小鼠脾细胞体外培养中用T细胞丝裂原ConA(伴刀豆蛋白A)和B细胞丝裂原IPS(脂多糖)分别刺激T、B细胞增殖，以DNA合成前体^3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)掺入法检测T、B淋巴细胞的增殖强度。结果：海洋无脊椎动物对T、B淋巴细胞具有ConA或IPS协同刺激作用或者抑制作用，其中10种有明显的剂量依赖性，6种呈现小剂量增殖、大剂量抑制的双向调节作用。结论：海洋无脊椎动物粗提物具有一定的免疫调节功能，这些数据为从海洋无脊椎动物中寻找天然药物活性前体奠定了基础。     

我国登革2型病毒43株非结构蛋白NS1基因的特征

对我国１９８７年从广西分离的登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸序列进行了分析，结果表明登革２型病毒４３株非结构蛋白ＮＳ１基因含有１０５６核苷酸编码３５２个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与我国１９８５年海南流行高峰期分离的Ｄ２－０４株、国际参考株新几内亚Ｃ株（ＮＧＣ）、牙买加株（ＪＡＭ）、候选疫苗株（Ｓ１）和马来西亚流行株Ｍ１（登革出血热）、Ｍ２（登革休克综合征）、Ｍ３（登革热）进行比较，发现核苷酸序列的同源性分别为９２．２％，９３．７％，９３．３％，９０．７％，８９．９％，８９．５％，８９．３％，氨基酸的类似性分别为８９．８％，９２．６％，９３．３％，９１．２％，９０．６％，９０．１％，８９；９％，推断的氨基酸序列含有两个糖基化位点，分别位于氨基酸残基的１３０和２０７位，一个可能的蛋白裂解位点３５０～３５２和１０个保守的半胱氨酸残基。     

猪囊尾蚴囊液16kDa特异性蛋白鉴定及其N-末端氨基酸序列测定

为了寻找猪囊尾蚴病诊断生物标记物,本研究从自然感染猪体肌肉分离、收集囊尾蚴,抽取囊液制备粗抗原,用其免疫家兔获得抗血清,再用SDS-PAGE分析囊尾蚴囊液总蛋白.以特异性抗血清通过Western Blot鉴定低分子量高特异性蛋白,测定其N-末端氨基酸序列并与相关资料进行对比分析,初步确定所鉴定蛋白归属.研究结果表明,从囊尾蚴囊液中鉴定出一低分子量为16 kDa的特异性蛋白,其N-末端起始的10个氨基酸序列为DLSKGEWQLV,该序列与猪囊尾蚴囊液肌红蛋白的同源性为80%.鉴于其对抗猪囊尾蚴血清具有高特异性和高反应性,可将其作为生物标记物,用于猪囊虫病的免疫学诊断研究.     

新型人冠状病毒NL63膜蛋白(M)基因的序列分析及其抗原表位预测分析

目的了解新发现的、与北京地区婴幼儿急性呼吸道感染相关的人冠状病毒HCoV-NL63的主要结构蛋白——膜蛋白（M）的基因特征。方法分别从2份已确认为HCoV-NL63阳性的、取自急性呼吸道感染患儿的标本（BJ3140和BJ8081）中用RT-PCR方法扩增得到其M蛋白的全基因，在对其进行了序列分析的基础上对推导出的M蛋白的抗原表位进行了预测分析。结果BJ3140和BJ8081的M蛋白编码基因全长681bp，编码一个含226个氨基酸的蛋白。BJ3140和BJS081之间M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．1％和99．6％；与HCoV-NL63原型株有很高的核苷酸（99．1％～99．7％）和氨基酸同源性（99．6％和98．7％），而与HCoV-229E的氨基酸同源性为61．3％，与HCoV-OCA3和SARS-CoV氨基酸同源性则低于31．0％。BJ3140和BJS081的M蛋白N端21个氨基酸位于病毒包膜外区，随后是3次跨膜区，最后是较长的包膜内区。不同方法的预测结果显示BJ3140的M蛋白的B细胞表位优势肽段多位于C-末端包膜内区域。结论从北京地区婴幼儿HCoV-NL63感染阳性的呼吸道标本中扩增得到的M蛋白编码基因与HCoV-NL63原型株有很高的同源性，具有与其他冠状病毒M蛋白相似的结构特征。     

中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定

目的 探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因，克隆并构建该基因的原核表达系统，鉴定表达产物的免疫性。方法 常规酚．氯仿法提取上述钩体的基因组DNA，高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统，不同浓度lPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPLI表达情况。分别用兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性。分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPLI血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用。结果 上述17株钩体均具有OmpL1基因，但至少可分3种基因型：OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。与文献报道比较，所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1／3基因核苷酸序列同源性分别为93．87％～94．08％、89．82％～100％和80．89％～81．72％，其氨基酸序列同源性分别为93．13％～98．75％、91．87％～100％和85．63％～88．44％。IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1．E．coli／BL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E．coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％。rOMPL1，1和rOMPLl，2均能与兔抗钩体TR／PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应，免疫家兔可获得抗体。兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1：2．1：32，1：2．1：16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A．1细胞。结论 所检测的钩体均有OmpLl基因，但至少可分为3种不同的基因型。所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性。rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原，能诱生交叉凝集抗体，并具有钩体黏附阻断的作用。     

四种hGM-CSF/IL-6融合蛋白的基因构建、表达及活性比较

目的 构建及表达具有hGM-CSF和hIL-6双重生物学活性的hGM-CSF／IL-6融合蛋白分子。方法 应用PCR技术对hGM-CSF和hIL-6的基因分别加以改造，同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3，克隆PCR产物，并构建成克隆有4种融合蛋白基因的pBV220表达质粒，4种融合蛋白分别是GM-CSF(9～127)-IL-6(29～184)(简称GII)、GM-CSF(9～127)-IL-6(1～184)(简称GL2)、GM-CSF(1-127)-IL-6(1—184)(简称GI3)、GM-CSF(9-127)-IL-6(24～184)(简称GI4)，表达质粒分别导入E．coli BL-21中诱导表达。通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用hGM—CSF依赖细胞株TF1和hIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性。结果 对4种融合蛋白基因的测序结果表明，其序列与理论设计完全一致，表达质粒在E．coli BL-21中均得到高效表达，表达的融合蛋白均占到总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在，通过Q Sepharose HP离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得4种目的蛋白，其纯度均达到95％以上。活性测定结果表明4种融合蛋白均具有较高的hGM-CSF和hIL-6的双重生物学活性。结论 获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF／IL-6融合蛋白。     

7型腺病毒疫苗株序列测定及其六邻体特性分析

目的 完成7型腺病毒疫苗株(Ad7v)的全序列测定并阐明其六邻体特征。方法 克隆Ad7v基因组17．5～68．0mu片段，应用Sanger双脱氧法进行DNA序列测定，将编码六邻体蛋白的核苷酸序列输入GenBank数据库中，获得录入号为AF515814。用CLUSTAL.V软件比较Ad7v与其他亚组及同一亚组腺病毒的六邻体蛋白的同源性，分析其抗原性的差异，同时用RasMol2．71软件预测Ad7v六邻体三维结构。结果 AdTv17．5～68．0mu由17596个碱基组成。这段基因r链主要编码晚期基因L1、L2和L3，L链编码E2的一部分。六邻体编码多肽位于L3区，由934个氨基酸残基组成，与其他9个已知的六邻体蛋白序列进行多序列同源性比较，发现Ad7／疫苗株与其他亚组腺病毒的同源性为86．8％(Ad4)～78．5％(Ad5)。在同一亚组中，Ad7疫苗株与Ad3同源性最高，高达95．1％。可变序列主要集中在7个高变区(HVRs)，根据Ad2六邻体三维结构模型预测Ad7六邻体三维结构，发现可变区大部分位于六邻体顶端的I1和I2环中。结论 完成了AdTv的全序列分析，其六邻体序列与Ad5、Ad2等其他亚组病毒有很大差异，这一结果为构建新型腺病毒载体打下了基础。     

风雨花甘露糖结合凝集素基因克隆与序列分析

单子叶甘露糖结合凝集素具有抑制人类免疫缺陷病毒的活性。风雨花 (Zephyranthes grandiflora)球茎中含有亚基分子量为 12 KD的甘露糖结合凝集素 (ZGA)。运用同源克隆的方法设计简并引物 ,通过 3'和 5 'RACE技术 ,从风雨花总 RNA中克隆了编码此凝集素的全长 c DNA序列 ,其开放阅读框长 4 92 bp,编码 16 4个氨基酸 ,包含信号肽序列、成熟蛋白序列和 C-末端剪切序列的前体蛋白。成熟蛋白由 10 6个氨基酸残基组成 ,分子量为 11.6KD。成熟蛋白在氨基酸水平上与石蒜凝集素、雪花莲凝集素、水仙凝集素和君子兰凝集素分别有 71.8%、81%、81.8%和 84 .5 %的同源性 ;在 Blocks数据库中检索 ZGA蛋白氨基酸序列的结构域 ,发现有 3个凝集素功能结构域 ,并具有 3个典型的甘露糖专一结合位点盒 (QDNY)