pEGFP-C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的 构建表达热休克蛋白27( HSP27)的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核载体,建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株.方法 采用RT-PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点的HSP27基因片段,插入真核表达载体pEGFP-C1,鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞,并筛选稳转细胞株.荧光显微镜观察HSP72的定位,RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达.结果 双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP-C1 -HSP27的DNA序列完全正确,并成功转染SW1990细胞,筛选获得稳转细胞株.荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中,转染细胞的HSP27mRNA表达明显增加(1.458±0.160比0.897 ±0.051,P＜0.05),且表达HSP27与EGFP的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pEGFP-C1-HSP27,并筛选获得稳转的细胞株.     

PRL-3真核绿色荧光蛋白表达载体的构建及其在结肠癌SW480细胞中的表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-PRL-3,为PRL-3基因功能研究奠定基础.方法:设计人PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW620细胞总RNA,应用RT-PCR方法获取人PRL-3全长cDNA,分别克隆至T载体及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染大肠癌细胞SW480,应用G418进行筛选获取PRL-3稳定表达细胞克隆,应用荧光定量PCR检测PRL-3基因表达.结果:获得522 bp的PRL-3基因编码序列并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFPN1-PRL-3,该重组载体能够在SW480细胞中稳定表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-PRL-3和建立PRL-3稳定表达SW480细胞,为进一步深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定基础.     

Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定

目的: 构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法: 设计人FADD特异性引物, 从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA, 通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA, 定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1. 应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定, 确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Western blot检测FADD的表达水平.结果: 测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因, FADD基因正确插入pEGFP-N1中, 在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达, Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高, 是未转染细胞的2.34倍.结论: 成功构建真核表达载体pEGF P-N1-FADD, 并且在SW480细胞中稳定表达.     

网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达

目的构建和鉴定网素蛋白基因(PLS)1和增强绿色荧光蛋白(EGFP)共表达慢病毒载体,并检测其在人结直肠癌细胞株SW480中的表达水平。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法克隆PLS1基因;将PLS1基因连接到带有EGFP的慢病毒表达载体p EZ-Lv201中构建慢病毒载体;将构建的慢病毒载体质粒p EZ-PLS1-SV40-e GFP-IRES-Puro(p EZ-PLS1)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-Pac HIV mix共转染293T细胞,收集慢病毒悬液;重组病毒转染H1299细胞,定量PCR法检测重组病毒滴度;将构建的p EZ-PLS1感染SW480细胞,荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后SW480细胞中EGFP和目的基因PLS1表达。结果基因测序分析证实克隆的PLS1基因与Gen Bank提供的序列完全一致;构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实PLS1正确插入p EZ-Lv201;定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×10~9~1.0×10~9TU/ml。在SW480细胞中重组病毒感染96 h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达,Western印迹检测到在SW480细胞中PLS1蛋白过表达。结论成功构建携带PLS1基因的重组慢病毒载体,在SW480细胞中有效表达。     

人FUT3基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.     

食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建

目的构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ.方法运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T-A克隆至pGEM-TEasy载体,再定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒pEGFP-C3-polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析.结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符.结论成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记.     

真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12的构建与表达

目的构建黑色素瘤抗原基因-12(MAGE-12)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,并在真核细胞中表达。方法于2005-10～2005-12对郑州大学第一附属医院应用RT-PCR方法,从人肺癌组织中扩增出MAGE-12cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至质粒载体(pGEM-Teasy),测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达。结果经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增出944bp的MAGE-12基因并成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达。结论成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12,为建立肿瘤细胞疫苗打下基础。     

pEGFP-C1-PTEN的构建及其在乳腺癌细胞ZR-75-1中的表达

采用分子克隆技术构建重组质粒人野生型PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-C1-PTEN),以脂质体转染法转染人乳腺癌细胞株ZR-75-1中,应用RT-PCR、Western印迹法分析目的 基因的表达.双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约1.2 kb,测序法进一步证实该基因为PTEN编码基因,经NCBIBLAST分析与Gene Bank中基因序列完全相同;RT-PCR、Western印迹显示pEGFP-C1-PTEN转染组有PTENmRNA及PTEN蛋白表达.成功构建了人野生型PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-PTEN,并将其成功转染入乳腺癌细胞ZR-75-1中,为研究PTEN在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

胰腺十二指肠同源框-1基因真核表达载体的构建和转染

目的应用阳离子脂质体介导含有大鼠胰腺十二指肠同源框-1（PDX-1）基因的真核表达载体转染胰腺导管上皮细胞。方法利用逆转录聚合酶链反应技术克隆大鼠PDX-1基因，酶切后插入经相同酶切及磷酸化处理的含绿色荧光蛋白（GFP）的空白载体pEGFP—C2，构成重组质粒，再进行HindⅢ、BglⅡ双酶切筛选、鉴定并测序；阳离子脂质体介导转染后，荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率从而对转染条件进行优化。结果限制性酶切分析证实重组后的载体成功载人PDX-1基因；克隆的目的片断经序列测定与Genebank公布的序列一致；转染条件优化后重组载体在胰腺导管上皮细胞中有效表达。结论在国内首次成功克隆了大鼠PDX-1基因，并构建了含有PDX-1基因的真核表达载体；通过优化转染条件提高了转染效率。为将表达PDX-1基因的胰腺导管上皮细胞作为组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

ERβ重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达

目的:基因重组技术构建重组质粒pEGFP-C1ERβ并检测其在结肠癌细胞株Caco-2中的表达.方法:应用RT-PCR从人结肠癌手术患者正常切缘组织中分离、扩增目的基因片段,将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列;脂质体介导重组质粒pEGFP-C1-ERβ瞬时转染Caco-2并上流式细胞仪分选,获得比较单一的转染细胞:分别采用RT-PCR、Western blot检测转染前后ERβ基因不同分子水平表达.结果:酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ构建无误:RT-PCR和Western blot分析均表明,与转染空质粒pEGFP-C1组和空白对照组细胞相比,转染重组表达质粒pEGFP-C1-ERβ组细胞ERβ基因表达水平明显提高.结论:成功构建重组质粒pEGFP-C1-ERβ并在Caco-2细胞株中表达,为进一步研究ERβ如何通过雌激素受体通路调控下游靶基因表达和参与结肠癌表遗传学发生机制奠定了基础.     

重组DNA甲基化酶1表达质粒对结肠癌细胞相关基因表达的影响

目的 分析DNA甲基化酶1(DNMT1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞肿瘤相关基因的表达影响。方法 分别构建并转染含有人正义和反义DNMT1的真核表达质粒入结肠癌SW1116细胞，PCR和限制性内切酶证实转染结果，以Western印迹法分析各组细胞DNMT1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2及c—myc、p16^INK4A基因的表达。结果 经G418筛选得到稳定转染DNMT1基因的结肠癌细胞系，且分别在该转染有正义和反义质粒的细胞系中，DNMT1蛋白表达上调和下调。同时发现转染正义DNMT1的细胞中hMLH1、hMSH2及c—myc的表达降低，而转染反义DNMT1的细胞中hMSH2的表达明显增强。各组细胞p16^INK4A基因的表达差异不明显。结论 DNMT1基因调控人结肠癌细胞中肿瘤相关基因的表达。     

FMNL2、Src、Talin在大肠癌细胞中的表达及其与调控的关系

目的:探讨上调或下调FMNL2表达与大肠癌细胞侵袭能力,以及该基因与Src、Talin表达的相关性.方法:将FMNL2-CT过表达重组慢病毒颗粒转染SW480和HT29大肠癌细胞,构建FMNL2干扰质粒沉默SW620大肠癌细胞,通过侵袭实验观察FMNL2表达量与细胞侵袭能力关系;Westernblot检测转染前后细胞Talin、Src表达情况,及PP1处理前后Talin、Src、FMNL2三种蛋白表达变化;荧光免疫共定位检测FMNL2、Src、Talin大肠癌细胞内定位.结果:高表达FMNL2的癌细胞侵袭能力较低表达者显著提高(51.20±8.00vs38.00±4.00,P<0.05).随着大肠癌细胞内FMNL2蛋白表达量的升高或降低,Src蛋白也上升或降低(F=15.659,P<0.05),Talin则反之(SW480F=540.595,HT29F=163.816,SW620F=125.507,P<0.01).PP1处理阻断Src通路后,FMNL2、Src蛋白含量均无明显变化,而Talin蛋白表达量随之减低.免疫共定位检测FMNL2与Src或Talin在胞浆和胞膜上存在共定位关系.结论:FMNL2可以显著促进结直肠癌细胞的侵袭能力,FMNL2处于上游参与调控Src、Talin表达,并可能通过Src间接影响Talin的表达进而参与对黏附斑转换的调控.     

RNAi对结肠癌SW480细胞Nucleostemin基因表达的影响

目的:探求RNA技术干扰人结肠癌SW480细胞Nucleostemin(NS)基因后,结肠癌SW480细胞NucleosteminmRNA和蛋白水平的表达,及细胞增殖情况变化.方法:构建Nucleostemin特异性真核表达载体,和脂质体共同转染SW480细胞后,采用Real-timePCR和Westernblot方法检测NS基因mRNA和蛋白变化,MTT法检测细胞的增殖情况.结果:与对照组相比较,RNAi干扰细胞后NSmRNA表达明显下降;NS蛋白表达亦明显下降(1.069±0.368,1.003±0.313,1.901±0.817,P<0.05;1.069±0.368,1.003±0.313,2.035±0.665,P<0.05),空白对照组(仅加入脂质体)和阴性对照组(RNAi错义序列)间无显著差异(2.035±0.665,1.9001±0.817,P>0.05).MTT显示RNA干扰后细胞增殖明显受到抑制.结论:通过特异性RNA干扰NS基因后,结肠癌SW480细胞增殖受到抑制.     

KAI1 gene expression in colonic carcinoma and its clinical significances

AIM: To investigate KAI1 gene expression in the progression of human colonic carcinoma and its clinical significances. METHODS: KAI1 expression was detected by in situ hybridization and immunohistochemistry in the 4 established cell lines of colorectal carcinoma with different metastatic potentials, and in 80 specimens of colonic carcinoma, 21 colonic carcinoma specimens with lymphatic metastasis and 20 controls of normal colonic mucosa. RESULTS: The expressions of KAI1 in HT29 and SW480 cell lines were higher than those in LoVo and SW620. The expression of KAI1 gene was significantly higher in colorectal carcinoma compared with normal colonic mucosa and lymphatic metastasis (chi(2)=46.838, P<0.01). The expression of KAI1 gene had no relationship with histological grade. The KAI1 expressions in Dukes A and B carcinoma were higher at both mRNA and protein levels compared to Dukes C carcinoma (chi(2)=16.061, P<0.05). The expression of KAI1 in colonic carcinoma specimens with lymphatic metastasis was almost lost. The results of in situ hybridization were in concordance with immunohistochemistry. CONCLUSION: KAI1 is highly related to the metastasis of colonic carcinoma and may be a useful indicator of metastasis in colonic carcinoma.     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人脂联素（APM1）基因真核表达载体，并检测其在HEK293细胞中的表达水平。方法用PCR法从测序正确的pGEM-T-APM1质粒上，扩增出两端带有Sfi Ⅰ酶切位点的人脂联素基因，再将扩增出的片段亚克隆到T载体上，用sfi Ⅰ酶切T载体和pCDEF空载体，将酶切后的片段进行连接、转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的pCDEF—APM1质粒转染HEK293细胞，ELISA检测培养上清中脂联素的水平。结果构建的pCDEF-APM1质粒能有效转染HEK293细胞，并在培养上清中检测到较高水平的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在HEK293细胞中获得高效表达。     

Ufd1基因沉默逆转SW1116／HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究

泛素融合降解1样蛋白（Ufd1）在蛋白质逆向转运中发挥一定作用。前期研究发现羟基喜树碱（HCPT）耐药人结肠癌细胞株SW1116／HCPTUfd1表达增高。目的：探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用。方法：干扰组SW1116／HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因．对照组转染非特异性siRNA。体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况。结果：干扰组SW1116／HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组（P〈0．05）。经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显。结论：以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关。     

Effect of deleted pancreatic cancer locus 4 gene transfection on biological behaviors of human colorectal carcinoma cells

AIM: To investigate the effect of deleted pancreatic cancer locus 4 (DPC4) gene transfection on biological behaviors of human colorectal carcinoma cells and the role of DPC4 gene in colorectal carcinogenesis. METHODS: PcDNA3.1-DPC4 plasmid was re-constructed by gene-recombination technology. SW620 cells, a human colorectal carcinoma cell line, were transfected with PcDNA3.1-DPC4 plasmid using lipofectamine transfecting technique. Transfected cells were selected with G418. Expression of Smad4 protein was detected in cells transfected with DPC4 gene by immunohistochemistry and Western blot. Biological characterristics of transfected cells were evaluated by population-doubling time and cloning efficiency. Alterations of percentage of S phage cells (S%) and apoptosis rate were determined by flow-cytometry. RESULTS: PcDNA3.1-DPC4 plasmid was constructed successfully. SW620 cells transfected with PcDNA3.1-DPC4 plasmid (DPC4+-SW620 cells) showed a strong intracellular expression of Smad4 protein, and the positive signal was localized in cytoplasm and nuclei, mainly in cytoplasm, where the expressions of Smad4 protein in SW620 cells transfected with PcDNA3.1 plasmid (PcDNA3.1-SW620 cells) and non-transfected SW620 cells (SW620 cells) were weaker than those in DPC4+-SW620 cells. The population-doubling time in DPC4+-SW620 cells (116 h) was significantly longer than that in SW620 cells (31 h) and PcDNA3.1-Sw620 cells (29 h) (P<0.01). The cloning efficiencies of DPC4+-SW620 cells (12%) were markedly lower than those of SW620 cells (69%) and PcDNA3.1-Sw620 cells (67%) (P<0.01). Compared with SW620 cells and PcDNA3.1-Sw620 cells, the Go-G1% of DPC4+-SW620 cells was obviously higher and the S% was markedly lower (P<0.05). Apoptosis rate of DPC4+-SW620 cells was significantly higher than that of SW620 cells and PcDNA3.1-SW620 cells. CONCLUSION: PcDNA3.1-DPC4 plasmid can be successfully re-constructed and stably transfected into human SW620cells, thereby the cells can steadily express Smad4. DPC4 protein may regulate proliferation of colorectal carcinoma cells by inhibiting cell growth and inducing cell apoptosis.