靶向XT-1基因shRNA真核表达质粒载体的构建及筛选

目的构建靶向木糖转移酶-1（XT-1）的短发卡状小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体;为寻找脊髓损伤治疗的新靶点提供工具。方法设计4个小分子短发卡状RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNAR的表达载体,进行酶切和测序,再转染体外培养的星形胶质细胞,筛选靶序列。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码XT-1-shRNA的质粒表达载体;该载体为寻找脊髓损伤治疗的新靶点奠定了基础。     

靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法设计两个小分子干扰RNA（siRNA）序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体,进行酶切鉴定和测序,再转染人大肠癌LoVo细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色,G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码EGFR—shRNA的质粒表达载体,并可以进行稳定筛选。     

大鼠STAT3基因靶向shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的针对大鼠信号转导子及转录激活子3（STAT3）基因序列,构建特异性短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。方法根据STAT3基因序列及shRNA设计原则,设计4条干扰效果最佳的shRNA,化学合成4对引物,通过PCR扩增获得dsDNA模板,采用DNA重组技术与pGCsi-U6/Hygro/GFP空载体连接,转化DH5a感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子,抽提重组质粒,进行DNA测序鉴定。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,测序结果与所设计的STAT3 shRNA转录模板序列一致。结论所设计的shRNA编码序列被正确地插入到质粒骨架中,成功构建了STAT3基因的shRNA表达载体。     

小鼠TRAF6基因shRNA真核表达载体的构建与表达

目的:构建并筛选肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)短发夹RNA(shRNA)表达质粒.方法:针对小鼠TRAF6 mRNA设计4条理论上最佳的siRNA序列,经退火成互补双链,将相应双链DNA插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组表达质粒pGCsi-TRAF6 -shRNA1,2,3,4,并以不同比例DNA质粒/脂质体转染重组质粒(1∶2、2∶5、1∶3和1∶4)至RAW 264.7细胞中,观察转染效果.结果:靶向TRAF6 mRNA的4个shRNA重组质粒载体pGCsi-TRAF6 shRNA1,2,3,4,经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功.应用荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/脂质体转染重组质粒(L)按1∶2、2∶5、1∶3和1∶4比例转染细胞的效率分别为13.7%±1.2%、24.5%±2.1%、19.3%±1.7%、16.3%±2.8%,以2∶5为最佳比例.只加了脂质体未加质粒(试剂对照)的细胞无荧光表达.结论:TRAF6靶向RNA干扰重组表达质粒构建成功,为进一步研究阻断TRAF6表达对急性肝衰竭过度炎症反应的基因治疗奠定基础.     

靶向XIAP的shRNA重组质粒的构建

目的:设计以X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制XIAP表达的效应,筛选RNA干扰作用最强的shRNA片段.方法:设计4对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达载体psiRNA-Hhneo-XIAP,通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2细胞中.采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blotting)方法检测XIAP的mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达差异,以判断各shRNA的干扰效应.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒.经质粒测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,XIAP基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强.shRNA作用48h后,对HepG2细胞中XIAP mRNA和蛋白的抑制率与3,4号重组质粒相比,均具有显著性差异(mRNA:94.5% vs 81.5%,82.6%,均P<0.01:蛋白:92.6% vs 80.7%,82.9%,均P<0.01).结论:成功构建了携带以XIAP为靶向的shRNA的重组质粒,其对肝癌细胞内XIAP的表达具有显著抑制效应.X染色体连锁凋亡抑制蛋白;;短发夹状RNA;;肝癌;;逆转录聚合酶链式反应;;免疫蛋白印迹     

靶向mcl-l基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的: 构建靶向髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法: 设计3对针对mcl-1基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNAfi片段的真核表达质粒(shRNAl-3)并行酶切鉴定和测序分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2中,48 h后测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western blot检测mcl-1 mRNA和蛋白表达情况.结果: 重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功.质粒在HepG2细胞中的转染率约为64%.shRNAl-3导入HepG2细胞48 h后.mcl-1,mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(0.61±0.02,0.56±0.02,0.46±0.01 vs 0.97±0.01,0.95±0.00;0.53±0.01.0.48±0.03,0_36±0.01vs0.90±0.03.0.88±0.01,均P<0.01).与shRNAl和shRNA2相比,shRNA3对mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强(52.6%VS 36.3%,42.9%:63.2%vs41.5%,49.6%,均P<0.01).结论: 成功构建并筛选出的靶向mcl-1的shRNA真核表达质粒对肝癌细胞HepG2内的mcl-1表达具有明显抑制作用.     

构建shRNA真核表达载体抑制人COX-2的表达

目的构建编码人环氧合酶-2(COX-2)mRNA的shRNA真核表达载体质粒,特异性抑制人COX-2的表达。方法以人COX-2mRNA编码区中2条不同序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA真核表达载体质粒,WBH1和WBH2,进行酶切鉴定和测序。用脂质体转染人胃癌细胞系SGC-7901,RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果WBH-1高效特异地抑制了人COX-2的表达,抑制率达70.42%;而WBH-2未产生抑制效果。结论通过构建COX-2的shRNA真核表达载体导入细胞可以有效地抑制人胃癌细胞中COX-2的表达,其抑制效果与靶点的选择高度相关。     

体外靶向TP53BP2基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的 本研究旨在构建靶向肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,以抑制肝癌细胞TP53BP2的表达。方法 设计了2对针对TP53BP2基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后,应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落PCR和测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,并采用Western Blot、qRT-PCR和激光共聚焦技术观察慢病毒Lenti-shTP53BP2对HepG2细胞TP53BP2基因的干扰效果。结果 测序比对结果显示,各重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示各重组慢病毒体构建成功;重组慢病毒载体经慢病毒包装后,显示pHS-ASR-LW429、pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513的滴度分别为9.7×10⁸ TU/mL、6.1×10⁸ TU/mL和6.4×10⁸ TU/mL;用慢病毒Lenti-shTP53BP2(pHS-ASR-LW512和pHS-ASR-LW513)感染HepG2细胞后,与...     

靶向RhoA基因的shRNA质粒表达载体的构建与鉴定

目的 利用pSilencer3.1H1 Hygro载体构建靶向大鼠RhoA基因的shRNA干扰分子表达载体.方法 选择RhoA基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化的pSilenter3.0.H1连接、转化大肠杆菌和序列测定,并在大鼠脊髓少突胶质细胞体外培养模型上验证构建的干扰载体的抑制靶基因表达的效果.结果 正确构建了针对BhoA基因RNA干扰分子的表达载体,构建的表达RNA干扰分子的表达载体能有效抑制体外培养的少突胶质细胞砌RhoA蛋白的表达.结论 成功构建了针对RhoA基因的shRNA表达质粒,为进一步研究脊髓损伤奠定基础.     

FAK基因靶向miRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建靶向黏着酶（FAK）基因的miRNA真核表达质粒,为其在胃癌相关研究中的应用奠定基础。方法设计合成两条针对FAK基因的特异性miRNA干扰序列,定向克隆到pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR真核表达载体上,经鉴定后转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR及Western—blot技术鉴定重组体对细胞FAK基因表达的干扰效果。结果针对FAK基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,转染BGC-823细胞后,细胞FAKmRNA及FAK蛋白表达均明显降低。结论针对FAK基因的miRNA真核表达质粒成功构建,该质粒可用于miRNA进行靶向FAK的相关研究。     

Effect of vector-expressed shRNAs on hTERT expression

AIM: To study the effect of short hairpin RNAs (shRNAs) expressed from DNA vector on hTERT expression. METHODS: Oligonucleotides coding for four shRNAs against hTERT were cloned into a mammalian shRNA expression vector pUC18U6 to form pUC18U6ht1-4, which were then introduced into HepG2 cells by using liposome-mediated transfection. HepG2 cells transfected by pUC18U6 and pUC18U6GFPsir, which expressed shRNA against green fluorescent protein (GFP), were used as controls. hTERT mRNA in the transfected cells were quantified by using real-time fluorescent RT-PCR. RESULTS: Among the four shRNAs against hTERT, two decreased the hTERT mRNA level. Compared with the controls, pUC18U6ht which expressed the two shRNAs reduced hTERT mRNA by 39% and 49% (P<0.05). CONCLUSION: hTERT expression is inhibited by the shRNAs expressed from the DNA vector.     

人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行West...     

大鼠叉头蛋白转录因子O1基因的shRNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

目的 构建针对大鼠又头蛋白转录因子哦O1（FoxO1）基因的shRNA慢病毒载体,并在大鼠系膜细胞（RMCs）上鉴定其沉默效率。方法利用四质粒合成法合成慢病毒载体。分别用阴性对照慢病毒载体（LV-shNC-GFP组）、shRNA慢病毒载体（LV-shRNA-FoxO1组）和感染增强剂（NC组）处理RMCs。72h后,采用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（GFP）阳性表达率。采用荧光定量PCR检测Fox01mRNA表达情况。15d后,采用蛋白免疫印迹法检测Fox01蛋白的表达情况。结果Lv_shNc_GFP、LV-shRNA-Fox01组GFP阳性表达率分别为87．4％、95．8％;Lv-shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量较NC、LV-shNC-GFP组均降低（P〈0.05）。其mRNA及蛋白抑制率分别达到86．2％和77．3％,而Lv_shNC-GFP、Lv_shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功构建大鼠FoxO1基因的shRNA慢病毒载体能高效、稳定地抑制FoxO1的表达,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定研究基础。     

短发夹状RNA对人肝癌细胞环氧合酶-2的抑制作用

目的:构建针对人环氧合酶-2(COX-2)基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒,观察其在不同时间点对人不同肝癌细胞株COX-2表达的影响.方法:以人COX-2mRNA编码区作为RNA干扰靶点,构建shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体分别转染人肝癌细胞株HepG2和Bel7402,利用逆转录聚合酶链反应和Westernblot法分别观察两株细胞转染后24,48,72,和96hCOX-2mRNA和蛋白的表达变化,检测抑制效果.结果:质粒在HepG2细胞和Bel7402细胞中的转染率分别约为60%和54%.WBH1导入细胞24,48,72和96h后,逆转录聚合酶链反应检测COX-2mRNA表达抑制率,HepG2细胞分别为18.5%,88.6%,52.8%和42.4%(P<0.01).Bel7402细胞分别为9%,45.1%,70.1%和56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.     

靶向人 BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的：构建靶向人 BRG1基因的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体并验证其沉默效率。方法：设计3个针对人 BRG1基因的特异性 shRNA 序列（shBRG1）,构建于 pLKO．1慢病毒载体中,并与 psPAX2和 pMD2．G 质粒共同转染293T 细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,应用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测 BRG1 mRNA 和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果：3种 shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低 BRG1 mRNA 表达水平（P 均＜0．01）。其中 shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC 后 BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降（P ＜0．01）。结论：靶向人 BRG1基因的 shRNA 慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低 BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

表达胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的:构建一个表达胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备能靶向性抑制GCRG213表达的重组腺相关病毒.方法:将构建好并经验证的包含胃癌相关基因GCRG213特异性小干扰RNA片段GCRG213-RNAi-2的IMG800-GCRG213i-2质粒用Bam H I Bg/Ⅱ双酶切,回收410 bp左右目的片段,将pSNAV2.0质粒用BamH I单酶切后同目的片段连接,经酶切和测序鉴定后,用新建质粒脂质体转染BHK-21细胞,G418筛选后大规模培养,再用辅助病毒HSV1-rc/△UL2感染,获取病毒.结果:成功构建包含U6启动子和胃癌相关基因GCRG213特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为5×10~(12)vector genome/L高滴度腺相关病毒.结论:载体的构建为进一步研究GCRG213的体内功能打下了基础,也将为更多的基因干预和基因的功能研究提供有效的工具.     

HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.     

血红素合成酶特异性RNAi表达载体的构建及其干扰效果鉴定

目的利用含红色荧光报告基因（DsRed）的pGCsi-U6／Neo／DsRed／质粒构建干扰人红系特异的γ-氨基-6-酮戊酸合成酶（eALAS）基因表达的短发夹RNA（shRNA）表达载体,并进行活性鉴定。方法根据GenBank中eALAS的序列,设计3条表达shRNA的互补DNA序列,分别克隆至质粒载体pGCsi-U6／Neo／DsRed中构建重组质粒,转化大肠杆菌DHSa菌株扩增后,提取质粒测序分析,以相同的方法构建并鉴定eALAS基因的真核表达载体pEGFP-N1-eALAS;将3种pGCsi-U6／Neo／DsRed／eALAS-shRNA分别与pEGFP-N1-eALAS共转染HEK293细胞株,通过流式细胞仪检测pEGFP-N1-eALAS融合蛋白的荧光强度,选择最佳RNA干扰（RNAi）靶点,并在基因和蛋白水平检测eALAS的表达,进一步验证最佳RNAi靶点的敲减效率。结果经测序,模板序列与设计序列完全正确,最佳RNAi靶点敲减效率达72．45％,eALAS在基因和蛋白水平显著下降。结论成功构建了eALAs特异性RNAi表达载体,为下一步研究铁效应元件eALAS在铁代谢异常所致红系统疾病的机制奠定了基础。