野生型p53基因对胃癌细胞生长及端粒酶活性的影响

本研究在确认存在 ｐ5 3基因突变和端粒酶阳性的胃癌细胞体外培养的条件下 ,观察野生型 ｐ5 3基因转染对胃癌细胞生长和端粒酶活性的影响 ,探讨二者变化的关系 ,同时观察野生型 ｐ5 3基因转染对胃癌细胞增殖与凋亡的影响 ,并分析细胞动力学改变与端粒酶活性的关系 ,从而探讨野生型ｐ5 3基因转染影响胃癌细胞生长的机制。一、材料与方法1.细胞 :中分化的人胃腺癌转移细胞ＳＧＣ790 1细胞株由中山医科大学动物实验中心提供。2 .真核表达载体ＰＣＥＰ4 /ｐ5 3、ＰＣＥＰ4 的扩增 ,纯化和酶切鉴定。3.基因转染 :胃癌ＳＧＣ790 1细胞株用含 15 %…     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

应用shRNA研究乙型肝炎病毒X基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞p53表达和活性的影响

目的应用短发夹状RNA介导的RNA干扰研究乙型肝炎病毒X基因（HBX）和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞p53表达和活性的影响。方法以2μmol／L As2O3处理HepG2细胞和表达HBX的HepG2-X，以未处理细胞为对照，提取细胞裂解物或胞核裂解物，采用改进的酶联免疫吸附法检测p53总量和相对活性吸光度。应用脂质体介导具有HBX序列特异性短发夹状RNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3转染HepG2-X，再次观察As2O3处理对D53表达和活性的影响。结果As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性。短发夹状RNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。结论As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。应用短发夹状RNA介导的RNA干扰有利于研究HBX的表达对p53表达和活性的影响。HBX表达上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性。     

SMMC-7721肝癌细胞系中p53与乙型肝炎病毒相互作用的研究

目的 进一步观察乙型肝炎病毒(HBV)与p53的作用关系，以便更深入地了解HBV对原发性肝细胞癌发生的影响。方法 选用SMMC-7721肝癌细胞系(表达野生型p53，HBV阴性)为靶细胞，采用脂质体转染法，将pCMVp53单独或者与野生型HBV质粒(pCMVHBVa)、变异型HBV质粒(pCMVHBVb)共转染细胞，用annexin V-FITC标记及流式细胞仪检测细胞凋亡的变化；各组分别共转染报告基因：PG13-CAT，含有p21基因启动子的p21-LUC，通过CAT酶以及荧光素酶的检测，观察p53活性情况以及对p21启动子的活化情况；western blot方法检测各转染组p53蛋白表达情况。结果 单独的pCMVp53质粒转染SMMC-7721细胞系能够促进p21报告基因的表达，细胞凋亡率升高；HBVa质粒与pCMVp53共同转染可使细胞中p53蛋白表达水平，p53对报告基因PG13-CAT的活化作用以及对p21基因启动子的激活作用增强，细胞凋亡率增加，细胞生长受到抑制，而与pCMVHBVb共转染时则不能。结论 HBV在细胞内的复制可能通过使p53蛋白半衰期延长，及p53蛋白的表达及作用增强，促进p53下游基因p21的转录，导致细胞凋亡率增强，细胞生长受到抑制;p53可能通过某种机制对HBV的复制具有一定的促进作用。     

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的：研究外源P53反义RNA对有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法：构建反义P53cDNA真核细胞表达载体,PEGFP－P53（AS）,经酶切图证明反向联结质粒,Lipofectin介质转染有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801－D,经G418筛选获耐受克隆,稀释法建立单细胞克隆系,PCR检测外源基因,荧光显微镜检测细胞绿荧光蛋白表达,P53单抗免疫组化染色检测P53突变蛋白表达,体外集落形成,检测细胞恶性生长。流氏细胞仪检测细胞周期,MTTI地检测细胞对顺铂药物敏感性。结果：酶切图证明了P53－cDNA反向联结于质粒,构建了PEGFP－P53（AS）,建立了转染单细胞克隆系PEGFP－P53（AS）－801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源P53基因和neo基因存在于转染细胞PEGFP－P53（AS－801D。荧光显微镜下发现胞浆有绿荧光蛋白表达,免疫组化染色P53突变蛋白801D细胞系为阳性,而PEGFP－P53（AS）－801为阴性,证明外源反义P53封闭转染细胞内源突变蛋白表达。与母系相比PEGFP－P53（AS）－801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01）,流氏细胞仪检测PEGFP－P53（AS）－801D细胞G1期细胞数明显增加,出现G1期阻止的表现,MTT检测PEGFP－P53（AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论：有P53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显,对顺铂耐药,外源P53反义RNA可封闭突变蛋白表达,抑制801D细胞体外恶性增殖,增加对顺铂的药物敏感性,证明P53突变的恶笥表型可以被抑制或野生型P53功能可得到恢复。     

大肠良恶性病变p53基因表达及意义

目的研究抗癌基因Ｐ５３蛋白在大肠良、恶性病变组织中的表达情况，探讨Ｐ５３蛋白表达与大肠癌临床病理因素的关系．方法应用免疫组织化学ＳＰ法检测了１４６例良恶性大肠病变组织中Ｐ５３蛋白水平．结果正常大肠粘膜及非肿瘤性息肉Ｐ５３蛋白均阴性，而１１例腺瘤，５３例癌旁粘膜及７６例癌组织中ｐ５３阳性率分别为１８１８％（２／１１），１３２１％（７／５３）及４２１１％（３２／７６）．在腺瘤及癌旁粘膜组织中，仅有散在细胞核里ｐ５３阳性，但在３２例ｐ５３阳性大肠癌中，７５％呈现（＋＋）或（＋＋＋）的阳性表达．在各组织类型癌中，以低分化腺癌与粘液癌ｐ５３阳性率最高，分别为６３６４％（７／１１）及６２５％（１０／１６），显著高于高中分化腺癌的３０１６％（１５／４０）（Ｐ＜００５），并且ｐ５３阳性大肠癌比ｐ５３阳性癌更容易穿透肠壁侵犯浆膜及浆膜外组织，其淋巴结转移率也明显高于ｐ５３阴性者（Ｐ＜００５）．但Ｐ５３蛋白表达与肿瘤大小，肉眼类型，部位，Ｄｕｋｅｓ分期及术后３年生存率无关．结论ｐ５３基因突变或过表达是大肠肿瘤发生过程中的重要因素，并可能与肿瘤进展及转移有关．     

hnRNP B1特异性小干扰RNA对肺癌细胞及p53表达影响的研究进展

核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)B1的高表达是肺癌频发早期事件,可能与细胞分化失调控有关. p53是目前公认的一种抑癌基因,当细胞受到各种信号刺激引起基因应激反应时,p53蛋白被磷酸化而变构从而被活化,抑制细胞的分裂、增殖和诱导细胞凋亡,防止细胞的恶性转化.应用RNA干扰技术中的小干扰RNA使hnRNP B1基因沉默,能使p53基因的活性增强,从而抑制细胞的恶性转化.本文就hnRNP B1特异性小干扰RNA对肺癌细胞p53基因表达影响的研究进展作一综述.     

外源性野生型p53基因对人肺癌细胞生长的抑制

目的观察外源性野生型ｐ５３基因对有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法用多聚酶链反应单链构象多态性及ＤＮＡ测序，选择ｐ５３基因突变的人肺巨细胞癌系８０１Ｄ为受体细胞。构建野生型ｐ５３表达质粒ＰＺＩＰｎｅｏＳＶｐ５３。用基因枪介导外源基因。建立转染细胞系８０１Ｄｐ５３。用聚合酶链反应检测外源基因，观察转染细胞恶性生长的变化。结果转染细胞系８０１Ｄｐ５３体外长期传代有ｎｅｏ基因及外源ｐ５３基因存在，转染细胞生长明显受到抑制，克隆形成抑制率达９６％，裸鼠异种移植致瘤性降低，肿瘤生长明显缓慢。结论外源性野生型ｐ５３经基因枪导入有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中，且明显抑制转染细胞的恶性生长     

野生型p53基因对肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的研究人野生型p53基因对肠癌细胞系SW480增殖及凋亡的影响。方法阳离子脂质体介导转染人野生型p53基因至SW480细胞系,利用MTT检测该基因对SW480细胞增殖的影响;利用Western blot检测CyclinD1及Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果与对照组比较,转染人野生型p53基因后的SW480细胞的增殖能力受到抑制;Cy-clinD1蛋白水平下调,Bcl-2、Bax表达呈负相关趋势。结论野生型p53基因在一定程度上可诱导肿瘤细胞凋亡。     

三氧化二砷对肾癌GRC-1细胞凋亡及p53、Survivin基因表达的影响

目的观察三氧化二砷(As_2O_3)对人肾癌GRC-1细胞凋亡及p53、Survivin基因表达的影响,探讨其作用机制。方法将体外培养的人肾癌GRC-1细胞分为对照组(N)和实验组,实验组根据加入As_2O_3浓度的不同分为A、B、C、D、E(2、4、6、8、10μmol/L)组。48h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化．免疫细胞化学和RT-PCR方法测定p53和Survivin基因表达。结果As_2O_3可抑制GRC-1细胞的增殖．当As_2O_3由2μmol/L增加到10μmol/L时,细胞增殖率由88．3%降低到18．7%(F= 7546．587,P＜0．01)。各实验组p53、Survivin基因表达均较对照组减少,且随着As_2O_3的增加表达呈递减改变(F=1120．741、F=6 296．535,P＜0．01)。结论As_2O_3能够抑制GRC-1细胞增殖,并且具有浓度依赖性。能将细胞阻滞在G_2/M期,诱导细胞凋亡,其作用机制与p53和Survivin基因表达水平下降有关。     

酪丝缬肽对人肝癌细胞SMMC-7721血管生成相关基因表达谱的影响

目的:观察小分子三肽化合物酪丝缬hk(tyroscryatide,YSV)对人肝癌细胞系SMMC-7721的抑制作用,并分析YSV对肿瘤细胞血管生成相关基因表达的影响.方法:建立人肝癌细胞SMMC-7721的体外培养体系,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测YSV对体外培养的SMMC-7721的增殖抑制作用,应用功能分类基因芯片分析人肝癌细胞SMMC-7721经药物作用后血管生成相关基因表达的差异变化,同时应用RT-PCR方法验证相关基因的表达.结果:YSV能显著抑制人肝癌SMMC-7721的生长,10mg/L YSV作用72h对SMMC-7721的增殖抑制率为42.34%,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).在113个血管生成相关基因中,YSV组相比对照组,基因下调0.667倍以上的有7个.RT-PCR在基因水平上证实YSV能显著抑制血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL-8)的表达.结论:YSV在体外能够显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并能在基因水平上下调肿瘤细胞血管生成相关因子的表达.     

RNA干扰p21对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默p21基因对肝癌细胞SMMC-7721增殖及恶性表型变化的影响.方法:通过慢病毒载体将p21小干扰RNA片段稳定转染入SMMC-7721细胞,通过RT-PCR,Western blot分别检MJp21 Mrna和蛋白表达变化,流式细胞仪检测7721-p2l RNAi组(感染p21 siRNA...     

Growth-inhibitory effects of MOB2 on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721

AIM:To investigate the growth-inhibiting and apoptosis-inducing effects of the gene MOB2 on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721.METHODS:The full-length cDNA of the MOB2 gene was amplified from human umbilical vein endothelial cells.The correct full-length MOB2 cDNA was subcloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-C1.After lipofection of the MOB2 gene into cancer cells,the levels of MOB2 protein in the cancer cells were detected by immunoblotting.To transfect the recombined plasmid vector pEGFP-CI-MOB2 into SMMC-7721 cells,the cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle'sMedium with 10% fetal calf serum and glutamine,and then mixed with liposomes,Lipofectamine 2000 and the plasmid vector pEGFP-CI-MOB2.RESULTS:We observed the growth and proliferation of SMMC-7721 cells containing pEGFP-CI-MOB2 and analyzed their apoptosis and growth cycle phases by flow cytometry.We successfully transfected the recombined plasmid vector pEGFP-CI-MOB2 into SMMC-7721 cells and screened for a single clone cell containing MOB2.After transfection,MOB2 enhanced growth suppression,induced apoptosis,increased the ratio of G0/G1,significantly inhibited the advance of cell cycle phase,and arrested cells in G0/G1 phase.CONCLUSION:MOB2 overexpression induces apoptosis and inhibits the growth of human hepatic cancer cells,which may be useful in gene therapy for hepatic carcinoma.     

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞TGF-β1基因表达的影响

目的探讨丹参酮ⅡA对人肝癌细胞TGF-β1表达的影响及其抗肿瘤作用机制。方法体外培养SMMC-7721肝癌细胞株，采用倒置相差显微镜、Hoechst 33342染色荧光显微镜观察，以及“梯状”DNA确定凋亡的发生并计算凋亡率；用RT—PCR方法检测肝癌细胞TGF．岛的表达。结果倒置相差显微镜观察可见各试验组细胞的生长不同程度受抑，并可见典型的凋亡形态改变；Hoechst 33342染色可见凋亡细胞核浓染，亮度明显加深或有染色质边集现象，亦可见典型的凋亡小体；提取基因组DNA电泳检测，出现典型的梯状条带；RT—PCR检测显示，丹参酮ⅡA作用48小时后TGF—β1表达量随药物浓度的增大而逐渐减低。结论丹参酮ⅡA可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的细胞增殖，促进其凋亡，此作用可能与细胞内TGF-β1表达下调有关。     

人p53/荧光蛋白融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位

目的 观察Ｐ５３基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况。方法 根据野生型Ｐ５３基因的编码顺序,ＰＣＲ主增突变的ＷＴ－Ｐ５３基因,使其３＇端的终止密友ＴＧＡ突变为ＴＧＡ突变为ＴＧＧ,用基因重组技术将共与绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｌｎ,ＧＦＰ）融合,通过真核表达质粒－脂质体介导,导入人高转移肝癌细胞系ＭＨＣＣ９７（ＰＣＲ检测有Ｐ５３基因突变）中、用荧光显微镜观察Ｐ５３     

Knockdown of survivin gene expression by RNAi induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721

AIM: To investigate the survivin gene expression in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 and the effects of survivin gene RNA interference (RNAi) on cell apoptosis and biological behaviors of SMMC-7721 cells. METHODS: Eukaryotic expression vector of survivin gene RNAi and recombinant plasmid pSuppressorNeo-survivin (pSuNeo-SW), were constructed by ligating into the vector, pSupperssorNeo (pSuNeo) digested with restriction enzymes Xba I and Sail and the designed double-chain RNAi primers. A cell model of SMMC-7721 after treatment with RNAi was prepared by transfecting SMMC-7721 cells with the lipofectin transfection method. Strept-avidin-biotin-complex (SABC) immunohistochemical staining and RT-PCR were used to detect survivin gene expressions in SMMC-7721 cells. Flow cytometry was used for the cell cycle analysis. Transmission electron microscopy was performed to determine whether RNAi induced cell apoptosis, and the method of measuring the cell growth curve was utilized to study the growth of SMMC-7721 cells before and after treatment with RNAi. RESULTS: The eukaryotic expression vector of survivin gene RNAi and pSuNeo-SW, were constructed successfully. The expression level of survivin gene in SMMC-7721 cells was observed. After the treatment of RNAi, the expression of survivin gene in SMMC-7721 cells was almost absent, apoptosis index was increased by 15.6%, and the number of cells was decreased in G2/M phase and the cell growth was inhibited. CONCLUSION: RNAi can exert a knockdown of survivin gene expression in SMMC-7721 cells, and induce apoptosis and inhibit the growth of carcinoma cells.     

WWOX induces apoptosis and inhibits proliferation of human hepatoma cell line SMMC-7721

AIM: To investigate the effects of the WWOX gene on the human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721.METHODS: Full-length WWOX cDNA was amplified from normal human liver tissues. Full-length cDNA was subcloned into pEGFP-N1, a eukaryotic expression vector. After introduction of the WWOX gene into cancer cells using liposomes, the WWOX protein level in the cells was detected through Western blotting. Cell growth rates were assessed by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and colony formation assays. Cell cycle progression and cell apoptosis were measured by flow cytometry. The phosphorylated protein kinase B (AKT) and activated fragments of caspase-9 and caspase-3 were examined by Western blotting analysis.RESULTS: WWOX significantly inhibited cell proliferation, as evaluated by the MTT and colony formation assays. Cells transfected with WWOX showed significantly higher apoptosis ratios when compared with cells transfected with a mock plasmid, and overexpression of WWOX delayed cell cycle progression from G1 to S phase, as measured by flow cytometry. An increase in apoptosis was also indicated by a remarkable activation of caspase-9 and caspase-3 and a dephosphorylation of AKT (Thr308 and Ser473) measured with Western blotting analysis.CONCLUSION: Overexpression of WWOX induces apoptosis and inhibits proliferation of the human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721.     

双萘酰亚胺类化合物诱导SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的 观察双萘酰亚胺类化合物(C8)对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的作用. 方法 四甲基偶氮唑盐法检测C8对SMMC 7721细胞的抑制情况;流式细胞术检测细胞周期和凋亡率;Western blot检测Bcl 2蛋白表达量;流式细胞术分析细胞内Bcl 2蛋白量;酶联免疫法检测Caspase9和Caspase 3表达量. 结果 C8抑制SMMC 7721细胞增殖,半数抑制浓度为15 umol/L.C8作用浓度在10,15、20 umol/L时,SMMC 7721细胞的凋亡比例分别为16.8%、29.4%和35.8%,对照组为2.1%,SMMC 7721细胞的凋亡率明显高于对照组,P<0.01.细胞内Bcl-2蛋白表达水平下降.酶联免疫检测结果表明Caspase 9和Caspase 3被活化.结论 C8可诱导人肝癌SMMC 7721细胞的凋亡,为抗肿瘤药物的研究提供新的化合物.     

LINE-1 ORF-1p过表达对肝癌细胞株SMMC7721增殖和锚定非依赖性生长的影响

目的研究逆转座子L1编码蛋白ORF-1p的表达对肝癌细胞株SMMC7721细胞增殖的影响。方法利用带Flag标签的L1 ORF1表达载体,转染SMMC7721细胞;采用Western blot法检测反转座子L1 ORF1编码蛋白ORF-1p的表达;采用软琼脂成集落实验和相关报告基因检测ORF-1p表达对肝癌细胞p53、p15和p21活性的影响。结果在SMMC7721细胞中,Flag-ORF-1p表达能够显著促进该细胞的增殖（P〈0.05）,增强该细胞的锚定非依赖性生长（P〈0.05）,降低p53、p15和p21报告基因的活性。结论 L1基因编码蛋白ORF-1p能够促进肝癌细胞的生长、浸润以及肿瘤的形成。