大鼠肝细胞的原代培养

目的探索肝细胞的分离和原代培养条件.方法两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,并将其培养在Hepatozyme-SFM培养基中,用MTT试验和尿素合成功能检测了解培养中的肝细胞的生物学活性.结果分离肝细胞的即时存活率为88%±2%,产量为(39±12)×106/g克肝脏;培养于体外的肝细胞维持形态稳定和尿素合成等功能达1周.结论应用两步灌流法可取得较好的肝细胞分离效果,应用Hepatozyme-SFM培养基能使肝细胞体外维持生物学功能达1周.     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

一种SD大鼠肝细胞原代培养的改良方法

目的 建立一种改良的大鼠肝细胞原代培养方法.方法取6到7周龄SD 大鼠（约200g）,3%戊巴比妥钠麻醉,采用Seglen两步胶原酶灌流法分离肝细胞,Percoll密度梯度离心纯化肝细胞,种植在预先用gelatin处理的培养皿内.结果 分离所得肝细胞成活率达95%以上.24h后用相差显微镜观察细胞贴壁良好,细胞形态规则;48h后细胞开始伸展.结论 使用改良的方法获得的细胞成活率高,贴壁牵,适合常见的药理毒理实验.     

肝脏灌注分离大鼠肝细胞及原代培养的方法

目的　建立分离及原代培养大鼠肝细胞的实验技术方法。方法　先后用无Ca2 灌流液及 0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶灌注大鼠肝脏 ,分离肝细胞 ,进行原代培养。结果　用台盼蓝排除试验测肝细胞活率大于 90 % ,产率大于 3 .0× 10 8个活细胞。结论　灌注分离大鼠肝脏可获得大量肝细胞 ,而且存活率高 ,原代培养 2 4h后肝细胞完全贴壁 ,形成单层     

介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法

目的介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法在Selgen两步胶原酶灌注法基础上加以改进,进行大鼠原代肝细胞分离。结果平均每只成年SD大鼠获取（1.56±0.31）×10^8个肝细胞,平均肝细胞活率（95.1±4.2）%,平均肝细胞纯度98%。结论本试验介绍方法简便易行,且肝细胞产量高、活力好、纯度高,适宜在一般条件实验室推广应用。     

一种培养幼小鼠肝细胞的方法

我国目前动物实验主要用小鼠进行。然而经典的Ｓｅｇｌｅｎ灌流肝细胞分离需采用门静脉插管灌流较难用于幼鼠 ,特别是幼小鼠。我们对Ｓｅｇｌｅｎ灌流法做了改进 ,将生后 2ｄ的 6 15幼小鼠肝细胞培养成功 ,现报告如下。1　材料和方法动物 :出生 2ｄ 6 15幼鼠。试剂 :Ｄ -Ｈａｎｋ’ｓ液 ,Ｈａｎｋ’ｓ液 ,ｐＨ 7.2 ,0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶 (购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ) ,含 10 %小牛血清完全培养基。肝细胞分离与培养 :取出生 2ｄ的 6 15幼鼠 ,2 5 %氨基甲酸乙酯 (4ｍｌ/ｋｇ体重 )腹腔注射麻醉 ,常规皮肤消毒 ,剖开胸腹腔 ,暴露心脏与肝脏 ,用 1…     

高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养

目的 :分离及培养高纯度的原代大鼠肝细胞。　方法 :用含EGTA的D Hanks液及含DNaseⅠ的胶原酶消化液分两步原位灌注大鼠肝脏 ,分离细胞经 3次低速离心 (5 0 g ,5min)后获得纯化的肝细胞。肝细胞存活率检测用锥虫蓝拒染法 ,纯度检测用苏木精 伊红染色。采用加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养 ,用倒置相差显微镜观察细胞活力。　结果 :每只 180～ 2 0 0 g的大鼠平均可获 (1.0～ 1.5 )× 10 8的细胞 ,存活率 >5 0 % ,纯度高于98%。培养 1、3、5天肝细胞的存活率分别为 10 0 %、94 .5 %、89.5 % ,形态良好。　结论 :改良原位灌注消化法分离肝细胞产率较高 ,活性较好 ,加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养能保持肝细胞良好的形态。     

小鼠肝细胞的分离培养

采用０．１％的胰蛋白酶消化乳化乳小鼠肝组织块，用ＤＭＥＭ２培养基进行肝细胞的培养，１周后可见细胞生长，３０ｄ左右细胞铺满培养瓶，培养的肝细胞能分泌白蛋白，培养第２０天白蛋白分泌量达高峰。     

一种简单分离、传代培养成年小鼠肝细胞的方法

目的　寻找肝细胞分离、传代培养更简单方便的方法。方法　应用不同胰酶浓度、不同消化时间消化成年小鼠肝组织后进行组织块培养 ,观察细胞的贴壁率、产量及活力。结果　胰蛋白酶分离成年小鼠肝细胞 ,于 MEM(含 2 0 %小牛血清 )培养液中 ,37℃密闭培养 ,生长情况良好 ,12小时左右即可完全贴壁 ,并已传至第二代。胰酶浓度为 0 .15 % ,消化时间15 m in,细胞产量及活率较高 ,每 10 g体重细胞产量为 0 .84± 0 .0 8× 10 7,细胞活力为 (90 .6 6± 5 .71) % ,贴壁生长 48小时细胞倍增 PD值为 0 .86± 0 .0 5。结论　胰蛋白酶消化、组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离、培养传代的简便方法 ,不需要特殊装置 ,酶耗费少 ,细胞采集可满足一般实验要求     

原代大鼠肝细胞分离与纯化方法

目的探讨改良、简化肝细胞的灌注、分离方法,以提高细胞产量,降低制作成本.方法对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,改变灌注方式,分离的大鼠肝细胞采用三次低速离心,台盼兰染色检测活率,并与Percoll梯度离心纯化法进行比较.结果大鼠肝细胞经低速离心后,活率仅（48.38±6.97）%.三次离心后再经Percoll梯度离心纯化后活率为（92.63±2.50）%,纯度〉95%,纯化前后活率比较差异有显著性（P〈0.01）.结论该方法要求设备简单、容易操作,细胞产量、活率及纯度高.     

三种原代大鼠肝细胞分离方法的比较

目的寻求一种高效、价廉的原代大鼠肝细胞分离方法。方法采用组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法对大鼠原代肝细胞进行分离。比较3种方法所获得的肝细胞的产率、存活率、纯度及胶原酶的用量。结果组织块法、胶原酶原位灌流法、改良二步胶原酶灌流法所获得大鼠原代肝细胞的产量分别(0.21±0.11)、(1.87±0.51)、(1.94±0.55)×108/只大鼠;存活率分别为(54.34±8.21)%、(85.18±4.90)%、(90.34±4.46)%;肝细胞纯度分别为(68.80±10.30)%、(85.12±2.87)%、(91.84±30.3)%;胶原酶用量分别为(17.38±2.13)、(78.75±20.83)、(31.2±12.46)mg/只大鼠。结论相比于组织块法和胶原酶原位灌流法,胶原酶二步灌流法为一种经济、高效的原代大鼠肝细胞分离方法。     

激素诱导大鼠离体肝细胞糖原分解的调节

利用大鼠肝细胞激素诱导磷酸化酶α激活,来研究不同激素对cAMP和Ca~(2 )依赖的糖原分解途径的调节。血管加压素和血管紧张素Ⅱ降低胰高血糖素诱导cAMP水平增加,呈明显的剂量效应关系。血管加压素、血管紧张素Ⅱ和苯肾上腺素诱导肝细胞~(45)Ca掺入及其激活磷酸化酶α的时间反应动力学近似。激素诱导离体肝细胞糖原分解具有不同的下调特点,这可能在体内有一定的生理意义。     

猪肝细胞的Gerlach分离法

目的 :探讨猪肝细胞分离收获率、存活率。方法 :取本地杂种小猪作为肝细胞供体 ,采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,血细胞计数板计数细胞产量 ,TrypanBlue拒染法计算细胞活率。结果 :每只猪肝平均可获得 (12 .2 2± 1.5 7)× 10 9个肝细胞 ,平均活力为 95 .4 %± 2 .4 1%。结论 :采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,获得较高产量和活力的游离肝细胞     

大鼠睾丸间质细胞分离及其鉴定

目的和方法 :通过血管冲洗、Ⅱ型胶原酶消化以及Percoll梯度离心 ,建立大鼠睾丸间质细胞分离方法。结果 :(1)Percoll密度梯度离心后纯化的间质细胞 3β HSD染色阳性百分率可达 85 %。 (2 ) 1.2× 10 -3 IU/mlhCG可显著性增加间质细胞睾酮的分泌 (P <0 .0 5 )。结论 :提示该方法可靠且具有一定应用前景     

人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

经心脏逆行置管灌注法在小鼠原代肝细胞分离中的应用

目的 观察采用经心脏逆行置管灌注肝脏的方法分离小鼠原代肝细胞的效果。方法 对传统的分离原代肝细胞方法(Seglen两步胶原酶灌注法)进行改良,即从小鼠右心房的裂口处经肝上下腔静脉向下方置管,并以输液器滴注含体积分数10%胎牛血清的胶原酶灌注液进行肝脏灌注。评价此法与传统方法的置管成功率及所得肝原代细胞的数量及活力。结果 改良组总的置管操作成功率高达95%,且在一次置管成功率上改良组高于传统组（94.7% vs. 68.8%,P<0.05）。改良组小鼠肝脏灌注均匀,肝细胞产量高达1.07×106/g小鼠体质量,细胞活力平均为92.16%,两者均高于传统组（分别为0.99×106/g小鼠体质量及86.44%,P<0.05或P＜0.01）。结论 经心脏逆行置管灌注法分离小鼠原代肝细胞简便易学,重复性高,且能保证分离所得的肝细胞产量和质量。     

胎肝细胞的分离培养及其功能的研究

目的探讨人胎肝细胞分离、培养的简单方法并证实其具有近似正常肝细胞的功能。方法取水囊引产中期(4~6月龄)妊娠死胎,用两步灌注法分离胎肝细胞,观察细胞形态及存活情况,并以正常成人肝组织作正常对照,检测胎肝细胞五种基因的表达,进行光密度分析。结果经台盼蓝染色、FDA荧光染色观察,细胞培养后11天内均存活良好,最长可存活18天;新鲜分离、培养3、5、7、10天组胎肝细胞均可表达GAPDH(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶)、ALB(Albumin白蛋白)、GS(Glutamine Synthetase谷氨酰胺合成酶)、CK(Cytokera-tin细胞角蛋白),经光密度分析证实,上述四种基因在培养肝细胞和正常成人肝细胞中的表达无明显统计学差异;AFP(Alpha Fetoprotein甲胎蛋白)基因表达明显强于正常肝细胞,并且于培养5天后呈显著的减弱。结论经分离、培养的人胎肝细胞存活良好,具有和正常成人肝细胞类似的基因表达。