抗华支睾吸虫抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

为了制备抗华支睾吸虫基因工程抗体,本从感染华支睾吸虫患的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR,扩增出约700bp的重链Fd段和轻链к、λ基因,经XhoⅠ和SpeⅠ,SacI和XbaI双酶切后,分别和质粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-blue菌株,将轻链和重链Fd基因先后克隆入pComb3中,成功地构建了抗华丽支睾吸虫Fas段抗体基因的表达载体,为进一步构建噬菌体抗体库奠定基础。     

人β2m基因的克隆及表达

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白,也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1],其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I类分子的天然构型的稳定性及其表达起关键作用[3,4]。MHC-I类分子在免疫系统中占有极其重要的地位,目前已趋向利用基因工程技术构建MHC-I类分子复合物以克服从体内获得的困难[5,6]。本研究成功地构建了其轻链β2m的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达。1 材料和方法1.1 材料E.coli C600…     

淋巴细胞分泌的免疫反应性生长激素的研究进展

目前已证明淋巴细胞分泌的ｉｒＧＨ是淋巴细胞的自分泌和旁分泌生长因子，其ｍＲＮＡ大小、ｃＤＮＡ序列、分子量与垂体分泌的ＧＨ是一致的，但分泌的调控机制不同。ｉｒＧＨ分泌的调控机制以及它对免疫细胞发育、活化、增殖等方面影响的研究，将有加深我们对神经内分泌系统与免疫系统之间相互关系的认识。     

用RT-PCR技术检测hSIM基因的表达

ｈＳＩＭ基因（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｉｎｄｅｄｇｅｎｅ）是新近发现的位于人类２１号染色体与胚胎细胞分化有关，并在人一些器官系统形成过程中起重要作用的基因。由于人基因组ｈＳＩＭ基因及ｈＳＩＭ基因ｃＤＮＡ均未克隆，研究ｈＳＩＭ基因表达对阐明该基因功能具有重要意...     

人sCD40L基因的克隆及表达

目的 克隆人sCD40L基因片段，并在原核细胞中表达。方法 用RT－PCR技术，从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增CD40L胞外区cDNA，并克隆至载体pGEM-T。测序验证后，转至载体PQE31中，并在大肠杆菌M15中进行表达，最后通过亲和层析柱得到纯化蛋白。结果 纯化所得的产物经Western blot证实，确为人sCD40L蛋白。结论 应用基因重组法构建了人sCD40L基因片段，并在原核细胞内成功地进行了表达，为今后进一步研究CD40L与凋亡、疾病的发病机制及临床治疗奠定了基础。     

用TCRβ可变区基因阵列反映疾病的淋巴细胞克隆变化

将正常脐带血TCRβ（T细胞受体β）重排基因制备成因阵列,观察能否反映肿瘤或自身免疫疾患者的淋巴细胞克隆的变化。方法：采用RT－PCR扩增混合10例脐带血的cDNA不同家族的TCRβ可变区基因全部序列,经测序胶或SSCP电泳后,电转移到尼龙膜上,制成TCRβ可变区基因阵列。用同位素α－^32P dCTP标记正常成人、脐带血、待检患者的TCRβ基因,与基因阵列杂交。结果;从测序胶排列的基基阵列发现,正常成人及脐带血呈正常高斯分布,即呈多克隆性;一些肿瘤患者T淋巴细胞克隆有少数几个克隆的异常增生,即呈寡克隆性;1例急性T淋巴细胞白血病患者仅在Vβ16见单一的条带扩增,呈单克隆性。结论：该基因阵列可以反映正常人淋巴细胞的克隆分布和疾病时出现的淋巴细胞变化。     

人生长激素基因在小鼠体内的表达

本文报道了含人生长激素ｈＧＨ ｃＤＮＡ的重组真核表达质粒的构建及其直接注射后在小鼠体内的表达水平。构建含ＣＭＶ晚期启动子的重组真核基因质表达质粒Ｒｃ／ＣＭＶ ＧＨ ｃＤＮＡ，以阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ和Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ分别包裹后直接多点注射于小鼠后肢肌肉组织，并用ＲＴ－ＰＣＲ及免疫放射检测分析法分别在转录水平及蛋白水平检测到了ｈＧＨ ｃＤＮＡ的表达。     

胎盘型谷胱甘肽转移酶基因在乳腺癌及腋窝淋巴结组织中的表达

目的：研究胎盘型谷胱甘肽转移酶（GST－π）在乳腺癌及其腋窝淋巴结组织中的表达情况与乳癌发生和临床耐药的相关性。方法：采用免疫组化及RT－PCR法分析临床乳癌标本及腋窝清扫淋巴结组织GST－π蛋白和mRNA的表达。结果：在正常乳腺组织,乳癌组织,HE阳性淋巴结,HE阴性淋巴结中GST－π蛋白阳性表达率分别为0,60％,77％,43％,GST－π mRNA阳性表达率分别为：0,88％,71％,39％,结论：在肿瘤启动和促进阶段GST－π表达增高,是一典型癌前病变标志酶,HE阴性淋巴结中出现GST－π阳性表达,提示预后不好,且在耐药反应性上 淋巴结灵敏性强于乳癌组织,GST－π基因表达的调控可能主要发生在RNA和（或）转录前水平。     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

恶性疟原虫信号肽肽酶原核表达载体的构建及融合表达蛋白的鉴定

目的构建恶性疟原虫PfSPP基因pMAL-p2x的原核表达载体,并鉴定表达,为其功能研究奠定基础。方法体外培养恶性疟原虫（3D7株和FCR3株）,提取虫体总RNA,进行反转录后,采用RT-PCR扩增PfSPP的全编码区基因,将其克隆入原核表达载体pMAL-p2x,PCR、双酶切鉴定重组质粒,并进行序列测定,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌进行表达获得MBP-PfSPP融合蛋白,采用Western blotting对表达产物进行鉴定。结果成功构建pMAL-PfSPP,转化菌经诱导表达出分子量约为77 000Mr的MBP-PfSPP融合蛋白,抗MBP多克隆抗体可特异性地识别表达的融合蛋白。结论成功表达具有多个跨膜结构的膜蛋白PfSPP,从而为深入研究PfSPP的酶活性及生物学功能奠定基础。     

人B细胞活化相关基因BC-1514全长cDNA的克隆与原核表达

目的 克隆与B细胞活化相关的新基因及其原核表达。方法 采用差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行入活化B细胞cDNA文库的筛选,将所获得的阳性克隆的编码区经PCR扩增后克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,重组质粒经酶切,测序鉴定后转化大肠杆菌BL-21,以IPTG诱导表达融合蛋白。结果 以在活化B细胞高表达的EST32为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库获得一个新的全长为1514bp的cDNA克隆（命名为BC-1514）,重组的BC-1514蛋白可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,其表达量约占细菌总蛋白量的14.3%左右,BC-1514cDNA的GenBank的登录号为AF304442。结论 获得了1条新的与B细胞活化相关的cDNA克隆并在E.coliBL-21中得到了有效表达。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

VEGF 3种受体在胶原性关节炎大鼠关节的表达与软骨破坏的相关性分析

检测血管内皮生长因子特异性受体在胶原性关节炎滑膜表达，并探讨其表达与关节软骨含量的相关性。采用RT—PCR方法检测VEGFR—1、VEGFR—2、VEGFR—3 mRNA表达，用GAPDH内参照相对定量VEGFR mRNA表达丰度。发现VEGFR—1在胶原性关节炎和对照组表达无显著差异；VEGFR—2、VEGFR—3在胶原性关节炎和对照组表达有显著差异。VEGFR—2、VEGFR—3 mRNA表达丰度与胶原性关节炎软骨含量呈负相关。提示VEGFR—2、VEGFR—3与类风湿关节炎软骨破坏有关，特异性阻断VEGFR—2、VEGFR—3可能改善类风湿关节炎预后。     

猫过敏原白蛋白的克隆表达、纯化和免疫学特性鉴定

目的 克隆、表达猫过敏原白蛋白(Fel d 2),并分析其过敏原活性.方法 提取猫肝脏总RNA,逆转录合成cDNA,采用适宜引物进行PCR扩增目的 基因,随后将其克隆到原核表达载体PET24a( ),在大肠杆菌中进行表达,镍亲和柱层析法提纯重组蛋白,Western blot检测其过敏原活性.结果 序列分析表明所克隆白蛋白的序列由1 752 bp组成,编码584个氨基酸,与Genebank上的基因序列(NM 001009961)同源性为99.9%.SDS-PAGE显示表达的重组白蛋白Mr65 000.免疫印迹表明重组白蛋白具有与猫过敏原过敏病人血清IgE结合活性.结论 表达的重组白蛋白具有与猫过敏患者血清IgE结合活性.     

中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体糖基结合域的原核表达与多克隆抗体的制备

目的：构建中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）H1和H2亚基糖基识别域（CRD）的原核表达质粒，体外表达纯化后制备多克隆抗体。方法：RT-PCR扩增出中国旱獭肝组织中ASGPR CRDH1和CRDH2 cDNA，将其克隆至原核表达载体pRSET-B中，在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS内诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功构建了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域原核表达质粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2，目的蛋白可以高效表达，用其免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论：首次成功表达了中国旱獭去唾液酸糖蛋白受体H1和H2亚基糖基识别域多肽，且纯度高，免疫原性强，用其免疫小鼠获得的多克隆抗体特异性好、效价高，为在HBV感染模型-中国旱獭体内进行肝脏疾病的靶向治疗奠定了实验基础。