VEGF shRNA表达质粒的构建及对血管内皮细胞VEGF表达的抑制

目的：构建大鼠血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shor thairpin RNA,shRNA）真核表达质粒,观察其对大鼠主动脉血管内皮细胞（ECs）中VEGF表达的影响.方法：采用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,构建表达质粒并通过脂质体介导转染ECs,采用RT-PCR,Western Blot方法分别检测VEGF mR-NA及蛋白质的表达.结果：经酶切和测序证实VEGF shRNA重组质粒构建成功.3条VEGF shRNA质粒均可下调VEGF mRNA和蛋白的表达,其中VEGF shRNA3质粒的抑制作用较强,转染72h时VEGF mRNA和蛋白的抑制率可分别达到71.91%和67.86%.结论：成功构建VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制ECs中VEGF mRNA和蛋白的表达,为利用RNA干扰技术从转录后水平抑制角膜新生血管的研究提供依据.     

抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.     

血管内皮生长因子重组DNA的构建及体外表达

目的:以质粒PCNDA3.0为载体,研究血管内皮生长因子(VEGF)目的基因在体外真核细胞中的表达.方法:将编码人可溶性VEGF165的目的基因克隆于带有CMV启动子/增强子的PCNDA3.0载体上,重组为PCNDA3.0-VEGF165质粒载体.直接以质粒DNA形式应用脂质体介导的方法转染人脐静脉内皮细胞ECV304,收取细胞上清,用ELISA和Western blot方法检测上清中VEGF165可溶性表达产物.结果:VEGF165基因在CMV启动子/增强子的调控下,可在ECV304细胞高效表达,且在转染后72 h表达量明显高于转染后48 h的表达.结论:以质粒PCNDA3.0为载体,VEGF165基因可以在体外真核细胞中表达,为治疗缺血性疾病提供一个新的基因治疗途径.     

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

构建人血管内皮生长因子cDNA逆转录病毒表达质粒

目的 :构建人血管内皮生长因子 ( VEGF) c DNA逆转录病毒表达质粒。方法 :采用 PCR方法从 pc DNA- VEGF165质粒中扩增 VEGF165基因 ,在序列两端分别引入 Eco R 和 Bam H 限制性内切酶识别位点 ,并克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中。结果 :酶切鉴定、PCR扩增以及DNA序列分析表明已经将 VEGF165基因全长序列克隆到逆转录病毒表达载体 p LXSN质粒中 ,获得了 p LXSN- VEGF165重组质粒。结论 :成功地构建了人 VEGF c DNA逆转录病毒表达质粒 ,为进一步临床应用 VEGF c DNA转基因治疗奠定了基础     

p27Kip1基因shRNA表达质粒的构建鉴定及功能研究

目的 构建细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响.方法 设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGenSil-1质粒,构建重组质粒pGenSil-1/p27Kip1-1、pGenSil-1/p27Kip1-2、pGenSil-1/p27Kip1-3、pGenSil-1/HK.转化DH5α菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定.以脂质体法将4个重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞.转染后48 h以Western blot法检测p27Kip1蛋白水平及MTT法检测各实验组和对照组细胞增殖情况.结果 酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功.3个实验组p27Kip1蛋白水平分别下降了66.41%、61.51%、71.32%,shRNA可显著促进牛角膜内皮细胞增殖.结论 成功构建了针对p27Kip1的RNA干扰表达载体.     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,研究血管内皮生长因子（VEGF）编码基因的siRNA对人视网膜母细胞瘤（RB）细胞的影响,从而探讨通过抑制血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤组织中的表达来治疗视网膜母细胞瘤的机理。方法将VEGF编码基因特异的siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞,采用RT PCR和Western blot技术检测siRNA处理前后RB细胞VEGF基因表达变化。MTT法检测siRNA处理前后RB细胞生长的抑制情况。结果RT PCR和Western blot均显示VEGF特异性siRNA对视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子基因的表达有抑制作用,MTT法检测RB细胞生长的抑制情况显示,抑制率可达40%。结论VEGF特异性siRNA的特异性基因沉默作用对RB细胞VEGF基因的表达有抑制作用。     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Realtime RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平。结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达。成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础。     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。     

针对大鼠ICOS基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠可诱导共刺激因子(inducible co-stimulater,ICOS)基因的特异性RNA干扰质粒,并进行鉴定.方法 采用U6启动子,分别把被9bp序列间隔的19bp长短的ICOS靶序列的反向重复序列,连接到线性化处理的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒中,分别构建ICOS短发夹环RNA(ShRNA),产生重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS.结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,并作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列.结论 针对大鼠ICOS基因的特异性RNA干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS的成功构建,为进一步研究阻断ICOS表达对实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)的影响奠定基础.     

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1．0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。     

Y-盒结合蛋白1短发夹环RNA真核表达载体的构建

目的:构建Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体.方法:采用人U6SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的YB-1靶序列的反向重复序列,置于pGensil-1质粒载体中,构建成YB-1短发夹环RNA,产生重组质粒pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13.分别用Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定;并将经酶切鉴定正确后的重组质粒作测序分析.结果:YB-1的特异性shRNA片段被成功克隆进pGensil-1质粒中,Sal Ⅰ酶切鉴定可切出400 bp大小的片段,DNA测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致.结论:成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13,为进一步研究其基因功能打下了基础.     

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果.方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因...