p16INK4A和 p15INK4B对人肝癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的　为探讨抑癌基因 p16 INK4 A和 p15 INK4 B对 Rb基因状态不同的人肝癌细胞系增殖和凋亡的影响。方法　在分析细胞系遗传背景鉴定基础上采用脂质体将构建的 p XJ- p16、p XJ- p15重组质粒转染人肝癌细胞系 BEL74 0 2 (p16 / p15 Rb )和 SMMC772 1(p16 / p15 / Rb- )。应用 PCR、RNA斑点印迹、MTT、集落形成、流式细胞仪等技术检测外源性 p16和 p15基因、m RNA表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。结果　经转染的 BEL74 0 2 - p16 ,BEL74 0 2 - p15细胞 ,分别存在外源性 p16、p15基因 ,在含外源基因细胞中相应的 m RNA表达增强 ;BEL74 0 2 - p15细胞生长速度、集落形成率显著低于对照细胞 BEL 74 0 2 (P<0 .0 1) ;细胞周期分析观察到与亲本细胞比较 ,BEL 74 0 2 - p15的 G1期细胞由 37.7%增高到 4 3.6 % ,S期细胞由 2 2 %下降到 13% (P<0 .0 5 ) ,并出现 G1亚峰 (凋亡峰 )。与此相反 ,BEL74 0 2 - p16细胞增殖未见抑制 ,细胞周期分布无明显差异 ,集落形成率也未见减少。此外 ,SMMC772 1- p16细胞增殖也无抑制。结论　外源性 p15 INK4 B具有抑制人肝癌细胞生长 ,诱导细胞凋亡的作用 ,其作用不受内源性p15影响。而 p16 INK4 A对肝癌细胞生长抑制的作用可能依赖于 RB途径的完整性。     

Bcl-2核酶诱导SMMC7721细胞凋亡与p16,p21蛋白表达的关系研究

目的　观察bcl 2核酶对人肝癌细胞株SMMC 772 1细胞的作用 ,并检测 p16和 p2 1的表达情况。探讨bcl 2核酶在肝癌治疗中的意义。方法　经脂质体介导的方法 ,将PMTr neo (正向bcl 2核酶真核表达载体 )导入SMMC772 1细胞中。细胞克隆转移扩大培养后 ,采用TUNEL法、免疫组化技术结合图像分析 ,在检测SMMC772 1/PMTr neo细胞凋亡的同时 ,检测 p16 ,p2 1的表达。结果　与对照组相比较 ,在bcl 2核酶诱发SMMC772 1细胞发生凋亡的同时 ,p16和 p2 1基因的表达水平显著增高。结论　bcl 2核酶通过封闭bcl 2的表达可促进SMMC772 1细胞凋亡 ,同时伴发 p2 1和 p16表达水平的增高     

HLA-B7可诱导启动子调控TNF-α和IFN-β基因协同增强抗肿瘤效应

目的　将TNF α和IFN β基因导入人肝癌细胞株Liu6和SMMC 772 1,以增强其免疫原性。方法　以腺病毒为载体 ,以IRES连接TNF和IFN基因 ,选择HLA B7可诱导启动子调控其表达。分别用Southern Northernblot和MTT法检测TNF α和IFN β基因的整合、转录与表达。流式细胞仪检测MHCⅠ类分子表达。CTL细胞毒性实验检测T细胞对转染细胞的杀伤作用。细胞增殖实验检测目的基因的表达对肿瘤细胞的抑制作用。结果　TNF α和IFN β基因可整合入转染细胞 ,并被有效转录。转染细胞MHCⅠ类分子的表达比对照组高 3～ 4倍。TNF活性 :Liu6细胞为 3 .778ng ml,SMMC 772 1为2 .0 17pg ml;2 4hIFN最高活性分别为 397.8U 10 6 个细胞和 345 .8U 10 6 个细胞。对照组与实验组在效靶比分别为 5∶1,10∶1,15∶1时 ,CTL细胞毒性实验结果差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ,表明T细胞杀伤作用明显增强。细胞增殖实验结果显示实验组与对照组差异有显著性 (P <0 .0 5 )。目的基因的表达对肿瘤细胞具有一定的抑制作用 ,抑制率分别为 5 .5 %(Liu6 ) ,3.7%(SMMC 772 1)。结论　人TNF α和IFN β基因导入人肝癌细胞株Liu6和SMMC 772 1可明显增加其对TNF、IFN和MHCⅠ类分子的表达 ,增强机体对转染瘤细胞的杀伤作用。     

机械刺激对肝癌细胞形态及增殖周期的影响

本研究采用“四点弯曲梁加载装置” ,对培养的人肝癌细胞株SMMC 772 1施以拉伸刺激 ,通过显微计算机图像处理系统了解其形态变化 ,流式细胞仪了解其增殖行为 ,结果发现 (1)加载 2 4h后SMMC 772 1G2 -M期 8.6 3% ,对照组 15 .92 %。 (2 )加载 72h后SMMC 772 1铺展投影面积缩小。 (3)加载 2 4h后SMMC 772 1分裂指数 0 .4 6 ,对照组 0 .5 5。加载可部分抑制SMMC 772 1的生长。     

异鼠李素体外抗肿瘤作用的研究

目的：观察异鼠李素对人细胞株A549、MCF-7、PC3、Caco-2、K562、AD293、Hacat等细胞增殖、分化的影响及相关基因的变化。方法：不同浓度异鼠李素处理上述细胞。光镜电镜下观察细胞形态；进行集落形成实验，^3H—TdR掺入实验、生长曲线法、MTT法测细胞生长抑制率；流式细胞仪检测凋亡峰及ban。bcl-2等凋亡相关基因的表达。结果：10～640ug／ml异鼠李素可抑制A549、MCF-7细胞生长，抑制率有剂量依赖性。     

肝癌患者CIK细胞的诱导及对肝癌细胞毒作用的研究

观察肝癌患者PBMC在体外诱导成CIK细胞的能力及其对肝癌细胞的细胞毒作用。对比正常人组和肝癌患者组CIK细胞和LAK细胞之间的扩增差异。用流式细胞仪检测CIK细胞表面标志CD3、CD5 6 ,3 H TdR释放法检测CIK细胞、LAK细胞对肝癌细胞系SMMC 772 1等多种细胞系的细胞毒作用。结果显示 ,肝癌组和正常组的CIK细胞扩增倍数分别达 6 4 3倍和6 7 4倍 ,CD3+CD5 6 +细胞扩增倍数均达 6 0 0倍以上 ,在细胞扩增曲线及细胞表面标志上无差异 ,远大于LAK细胞 ;肝癌组CIK对肝癌细胞SMMC 772 1、Bel 74 0 2、Hep 3b杀伤能力均达 6 5 %～ 81% ,与正常组相同 ,且与对肠癌细胞系HIC 2 5 1杀伤能力无差异 ;对正常胎肝细胞系L 0 2的细胞毒作用 <5 % ;肝癌患者CIK对耐药的和未诱导耐药的K5 6 2细胞细胞毒作用均达到 70 %左右。肝癌患者CIK和正常人CIK一样对肝癌细胞有很强的细胞毒作用 ,对耐药肿瘤同样有效 ,对正常肝细胞无损伤 ,具有临床应用前景     

LFA-1与抗CD3 mAb共刺激对狼疮肾炎PBMC增殖和IgG合成的影响

目的 :探讨LFA 1与抗CD3mAb共刺激对狼疮肾炎 (LN)患者外周血单个核细胞 (PBMC)增殖与免疫球蛋白 (IgG)合成的影响。方法 :分离LN患者及健康人 (正常对照 )的PBMC ,采用Ficoll梯度密度离心法。细胞增殖实验采用3 H TdR掺入法。IgG测定采用ELISA法。结果 :在抗CD3mAb诱导下 ,2 9例LN非活动期和活动期PBMC中 ,3 H TdR的掺入量和IgG的合成均增加 ,且活动期的增殖强于非活动期 (P <0 .0 1) ;而单纯用抗CD3mAb对 12例正常对照的PBMC没有影响 (P >0 .0 5 )。抗CD3mAb与抗LFA 1mAb共刺激 ,均可增加LN患者 (活动期和非活动期 )及正常对照PBMC3 H TdR掺入量和IgG合成 ,其中活动期增殖效应强于非活动期 (P <0 .0 1) ,后者又强于正常对照 (P <0 .0 1)。抗LFA 1中和抗体的加入 ,可明显抑制LFA 1诱导的共刺激效应 (P <0 .0 1)。结论 :LFA 1促进LN患者PBMC增殖和IgG合成 ,可能是其参与LN发病的机制之一     

超声辐照对血管紧张素Ⅱ诱导的牛主动脉平滑肌细胞增殖的影响

为观察不同剂量的超声辐照对牛主动脉平滑肌细胞 (CASMC)增殖的影响 ,寻找出抑制细胞增殖的最佳辐照剂量 ,利用体外培养的牛主动脉平滑肌细胞 ,用细胞计数法、MTT法、3H 胸腺嘧啶核苷 (3H thymidine,3H TdR)掺入法测定细胞增殖率的变化 ,观察不同浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞增殖的影响以及不同剂量的超声辐照对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增值的预防和逆转作用。细胞计数、MTT法、3H TdR掺入法均显示 1 0 - 9～ 1 0 - 7mol L浓度的AngⅡ可使血管平滑肌细胞数明显高于对照组 (P <0 0 5 ) ;而用一定剂量超声辐照后 ,AngⅡ诱导的上述作用被明显抑制 (P <0 0 5 ) ,提示一定频率和剂量的超声辐照可以抑制CASMC增殖     

几种抗癌药物对小鼠白血病L_(7212)肝脾的~3H-TdR掺入的影响(摘要)

可移植性615小鼠淋巴白血病L_(7212)是我国建立的实验白血病模型之一。本文观察了L_(7212)小鼠发病进程中肝、脾的~3H—TdR掺入变化及环磷酰胺、氮芥、靛玉红、促肾上腺皮质激素对其~3H—TdR掺入的影响。实验结果表明: 1、接种六天的L_(7212)小鼠肝、脾DNA的~3H—TdR的掺入量随注射~3H—TdR的时间而逐浙增加,在注射~3H—TdR后2—4小时掺入量趋于平稳。肝脏的掺入量比脾脏相应时间的掺人量高,速度也较快。说明白血病发病时小鼠肝脏的DNA合成比脾脏更为旺盛。 2、615小鼠在接种白血病L_(7212)后,小鼠的肝、脾被白血病浸润逐浙加重,肝脾指数     

db-cAMP对转化细胞增殖抑制及其对CaM水平和PKⅡ活性的影响

目的　探讨双丁酰 环核苷酸 (db cAMP)对转化细胞增殖及细胞表型作用的机理。　方法　以流式细胞光度术 (flowcytometry ,FCM)、软琼脂集落形成、放射免疫、Northern印迹和激酶活性分析等方法观察db cAMP对转化的C3H1 0 T1 2 小鼠成纤维细胞增殖、细胞表型、钙调素 (calmodulin ,CaM)表达及蛋白激酶Ⅱ (proteinkinaseⅡ ,PKⅡ )活性的影响。　结果　db cAMP(1mmol L)使C3H1 0 T1 2 转化细胞增殖及软琼脂集落形成能力受到显著抑制 ,转化细胞中CaM的表达及PKⅡ活性明显高于正常细胞 ,经db cAMP处理后也受到明显抑制。　结论　细胞转化及cAMP的诱导分化作用与PKⅡ活性的改变有密切相关性     

miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响

 目的: 研究微小RNA-141(miR-141)在人肝癌细胞和正常胎肝细胞中的表达,同时分析miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响。方法: 分别提取人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞HL-7702的总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测miR-141的表达。采用脂质体介导的转染方法分别将miR-141 mimic转染SMMC-7721细胞,将miR-141 inhibitor转染HL-7702细胞;MTS试剂盒和BrdU-ELISA检测细胞增殖能力,流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡率的变化。Transwell实验检测miR-141表达变化对细胞体外迁移能力的影响。结果: miR-141在SMMC-7721细胞中的表达较HL-7702细胞明显下降。与空白组、脂质体组和阴性对照组相比,转染25 nmol/L miR-141 mimic的SMMC-7721细胞中,细胞增殖速度减慢,S期细胞比例降低,凋亡细胞比例上升,细胞体外迁移能力下降;转染50 nmol/L miR-141 inhibitor的HL-7702细胞中,细胞增殖速度加快,S期细胞比例上升,凋亡细胞比例下降,细胞体外迁移能力增强。结论: miR-141在人肝癌细胞中表达下降,上调miR-141表达可抑制肝癌细胞体外增殖活性和迁移能力,影响细胞周期和凋亡。在肝癌发病进程中,miR-141可能扮演抑癌基因的角色。     

人突变p27基因对大肠癌细胞生物学行为的影响

目的： 观察人突变p27基因（p27mt）对人大肠癌细胞生长的影响，探讨p27mt基因在大肠癌基因治疗中的作用及可能机制。方法： 以携带突变p27基因复制缺陷型腺病毒（Ad-p27mt）为载体，转染大肠癌细胞SW480；Western blotting方法检测p27mt蛋白的表达；细胞计数法检测p27mt对SW480细胞生长的抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期；用DNA片段分析法检测细胞凋亡。结果： Ad-p27mt转染SW480细胞后，p27在细胞中出现了蛋白高表达;77.96%的细胞阻滞于G₀/G₁期，而Ad-LacZ组及空白对照组分别为27.57%和25.29%；生长曲线显示Ad-p27mt对细胞生长有明显的抑制作用；DNA片段分析示p27mt基因可诱导细胞的凋亡。结论： p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，主要阻滞于G₀/G₁期；p27mt基因对细胞的生长抑制机制与诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞有关。     

RNAi沉默Beclin 1基因对维生素K3损伤人肝癌细胞SMMC-7721的影响

目的： 探讨应用RNAi技术沉默Beclin 1基因对维生素 (vitamin K3,Vit K3)引起的人肝癌SMMC-7721细胞损伤的影响。方法: 应用真核细胞转染技术将Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重组质粒转入人肝癌SMMC-7721细胞,同时分别设立转染空质粒阴性对照组和转染试剂阴性对照。于48 h后收集细胞,分别提取细胞总RNA及总蛋白,通过RT-PCR和Western blotting检测Beclin 1基因表达。应用40 μmol/L Vit K3作用Beclin 1-siRNA细胞株,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率。结果: 与对照组相比,siRNA重组质粒明显降低Beclin 1 mRNA水平,抑制其蛋白表达。40 μmol/L Vit K3作用人肝癌SMMC-7721细胞Beclin 1 mRNA表达明显高于对照组,细胞凋亡率增加(P<0.01）;而Beclin 1-siRNA细胞株,Beclin 1 mRNA表达显著低于对照组,与40 μmol/L Vit K3作用组相比细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论: Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1转染人肝癌SMMC-7721细胞后,可有效抑制Beclin-1 mRNA和蛋白的表达,抑制Vit K3引起的Beclin 1依赖性细胞自噬信号通路的激活,促进细胞凋亡。     

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖与迁移

目的:观察高表达的miR-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的miR-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒构建miR-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p的表达;CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测SMMC-7721细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:设计的miR-15a-5p序列与寡核苷酸测序结果匹配达100%;真核表达质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-15a-5p的表达量与对照组相比显著增加(P0.05);miR-15a-5p高表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(P0.05);miR-15a-5p高表达组细胞迁移速度低于对照组。结论:高表达的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力。     

P53 shRNA对肝癌细胞增殖的影响

 目的 观察用RNA干扰（RNAi）下调SMMC-7721人肝癌细胞系P53表达后对细胞增殖及P21蛋白表达的影响。方法 设计合成P53基因的短发夹RNA（shRNA）,并构建pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA重组质粒。重组质粒转染SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆。克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及Western blot法分别检测P53、P21的mRNA及蛋白表达。BALB/c裸鼠皮下注射SMMC-7721细胞,建立移植瘤模型,瘤部位多点注射pGPU6/GFP/Neo-P53 shRNA,观察瘤体积变化和瘤重。结果 P1、P2、P3三条P53 shRNA均可明显降低P53 mRNA水平（P<0.05, P<0.05, P<0.01）;干扰P53表达明显升高SMMC-7721细胞克隆形成率（P<0.05）,P21 mRNA和蛋白的表达均随着P53的沉默而显著降低（P<0.05）。P53 shRNA明显增加裸鼠移植瘤的体积和重量（P<0.05）。结论 shRNA干扰P53基因可抑制P53和P21蛋白表达,使癌细胞恶性增殖。     

重组腺病毒介导的人AWP1基因转移对人源肝癌细胞增殖的影响

目的以重组腺病毒作为AWP1（associated with PRK1）的转基因载体,研究AWP1对人肝癌细胞增殖的影响,为进一步研究AWP1基因功能提供依据。方法重组腺病毒质粒pAd-flag-AWP1转染293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,并进行PCR鉴定。用空病毒Ad-Null和重组腺病毒Ad-flag-AWP1分别感染人源肝癌细胞SMMC-7721,并于感染后24 h、72 h、第5天和第7天收集细胞计数,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间。结果重组腺病毒Ad-flag-AWP1能够感染SMMC-7721细胞;依据细胞生长曲线计算的SMMC-7721细胞倍增时间分别为：SMMC-7721细胞约为5 d;而Ad-Null感染后其生长被抑制,倍增时间约为6 d;Ad-flag-AWP1感染后,其倍增时间约为3 d。结论重组flag-AWP1腺病毒转染SMMC-7721细胞过表达的AWP1蛋白可能具有促进人肝癌细胞生长的作用。     

三氧化二砷对肝癌细胞生长抑制作用差异性探讨

目的:观察三氧化二砷对肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞生长抑制作用差异性并且探讨其可能的作用机理。方法: 应用细胞培养和台盼蓝拒染法观察不同时间和不同浓度的三氧化二砷对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402细胞生长的抑制作用,比较生长抑制率的差异并用谷胱甘肽检测试剂盒测定两种肝癌细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。结果: 三氧化二砷浓度为0.50 μmol/L、作用时间为24 h可显著抑制肝癌细胞系BEL-7402的生长,抑制作用呈时间、剂量依赖性;对SMMC-7721细胞,三氧化二砷浓度为2.00 μmol/L、作用时间为24 h才出现抑制细胞生长作用,二者的生长抑制率存在显著差异,0.25-2.00 μmol/L As₂O₃作用72 h后,BEL-7402细胞的生长抑制率均高于SMMC-7721细胞(P＜0.05)。检测SMMC-7721和BEL-7402细胞内GSH含量分别为(50.8±5.2)μmol/g protein和(18.7±1.4)μmol/g protein,存在明显差异。 结论:三氧化二砷抑制肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402的生长存在显著的差异;BEL-7402细胞对三氧化二砷非常敏感性,可能与其细胞内谷胱甘肽含量较低,细胞的氧化还原解毒系统不足有关。     

肝细胞癌新型靶向基因治疗体系的构建及应用研究

构建肝细胞癌(HCC)新型靶向基因治疗体系,并以存活素(survivin)基因为靶点,探讨该体系体外杀伤肝癌细胞的作用。构建由巨细胞病毒(CMV)增强子和甲胎蛋白(AFP)启动子构成的融合启动子(AV)驱动的pcD-NA3.1(-)AV质粒,及含绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA3.1(-)AVGFP和含siRNA-survivin的pcDNA3.1(-)AV-siRNA-survivin质粒,以磷酸钙纳米为载体,导入HepG2、SMMC-7721和Hela细胞中,观察转染效率及体外对肝癌细胞的杀伤效应,并采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果显示:AV启动子可特异性驱动下游基因在HepG2细胞表达。此外,pcDNA3.1(-)AVsiRNA-survivin在HepG2细胞中可有效沉默survivin的mRNA和蛋白表达,并诱导68.8%的细胞死亡,而在Hela和SMMC-7721细胞中无显著作用。生长曲线结果显示,转染了pcD-NA3.1(-)AVsiRNA-survivin的HepG2细胞的生长显著受抑(P<0.05)。结果表明,该新型靶向基因治疗体系可高选择性作用于肝癌细胞,可为临床肝癌的基因治疗提供新的研究思路。     

Nutlin-3 促进肝癌细胞SMMC-7721 发生焦亡的作用

目的:探讨MDM2 拮抗剂Nutlin-3 促进肝癌细胞SMMC-7721 发生焦亡的作用及相关机制。方法:Western blot 检测细胞中活化caspase-1(p20)及IL-1β的表达,LDH 法检测SMMC-7721 细胞焦亡情况,ELISA 检测细胞上清中IL-1β释放情况。结果:Nutlin-3 提高SMMC-7721 细胞活化caspase-1(p20) 及IL-1β的蛋白表达水平。Nutlin-3 处理显著提高了SMMC-7721 细胞培养上清中的LDH 及IL-1β的表达水平(P<0.05)。结论:Nutlin-3 激活了caspase-1,诱导肝癌细胞SMMC- 7721 发生焦亡,并促进IL-1β释放。     

肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响

目的:探讨肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响。方法:采用脂质体法,以重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染肝癌细胞系SMMC-7721,经G418稳定筛选、克隆及扩增,采用RT-PCR、Westernblot和免疫细胞化学(ICC)染色法,检测目的基因及其蛋白的表达。用FACS检测细胞周期的变化;电镜技术观察细胞的超微结构;体外运动、侵袭实验检测细胞运动及侵袭能力;并应用基因芯片技术检测相关基因的差异表达。结果:RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66的细胞中OVA66基因呈高表达。Westernblot显示,在OVA66蛋白处出现明显的条带。电镜和FACS检测表明,该基因可增强肿瘤细胞的增殖能力。体外运动、侵袭实验证实,该基因可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭。基因芯片显示,该基因的高表达可促进Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)等基因的表达,影响肿瘤的侵袭和转移。结论:OVA66基因及其蛋白可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列生物学功能。