RNA干扰技术特异性抑制肾癌survivin表达的实验研究

目的:体外转录合成survlvin siRNA(Small interference RNA,siRNA),观察其在肾癌786-O细胞株中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成3组survivin序列特异性双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),转染786-O细胞株中,用RT-PCR和Western blot检测转染后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞活性.结果:有2组转染特异性siRNA的786-O细胞表达survivin mRNA及蛋白均下调.活性受到抑制,另一组效果不明显.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制肾癌786-O细胞中survivin的表达,抑制细胞的活性,RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术可能为肾癌的基因治疗提供一种新策略.     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

Survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中表达的实验研究

目的:检测抗凋亡基因survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中的表达并探讨其临床意义.方法:运用MTT(四唑盐比色)法检测细胞生长状态并绘制生长曲线,运用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法和免疫组化法检测786-O细胞株中survivinmRNA及survivin蛋白的表达情况.结果:检测出786-O细胞株中有survivin mRNA的表达,survivin蛋白的表达亦呈阳性,而正常肾细胞无阳性表达.结论:survivin mRNA及survivin蛋白在肾透明细胞癌中均有明显的表达,利用这一表达特异性,为以survivin基因为靶点的肾癌基因治疗研究提供了实验依据.     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

RNAi沉默survivin基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4 DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化.结果 酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的EJ细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论 重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.     

沉默survivin对增加晚期宫颈癌基因放疗效果的实验研究

目的探讨survivin表达抑制与晚期宫颈癌放疗敏感性的关系。方法设计并构建靶向survivin的shRNA真核表达载体（psh-svv）,转染宫颈癌Hela细胞,用实时PCR法检测RNA干扰（RNA interference,RNAi）后survivin mRNA的表达,用Western blot检测survivin蛋白表达,观察survivin基因沉默后放射线对Hela细胞生长活性的作用,转染psh-svv对Hela细胞凋亡的影响,裸鼠移植瘤生长速度及对放射线敏感性的变化。结果测序结果证实载体构建成功。转染psh-svv的实验组survivin mRNA表达明显低于3个对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。实验组survivin蛋白表达亦明显低于3个对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。放疗后72h实验组细胞生长抑制率明显高于3个对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。实验组caspase-3活性显著高于其他3组（P〈0.05）。survivin基因沉默后,裸鼠移植瘤生长速度减慢,survivin低表达的实验组小鼠对放射线敏感。结论 psh-svv通过RNAi有效降低宫颈癌Hela细胞survivin的表达,抑制Hela细胞增殖,诱导凋亡,增加Hela细胞对放射线的敏感性。     

慢病毒介导RNA干扰Clusterin基因表达载体的构建及其在肾癌786-O与ACHN细胞系中的表达

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度＞4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.     

siRNA干扰BIRC6对肾癌786-O细胞凋亡和自噬的影响

目的 研究杆状病毒IAP重复序列蛋白6（BIRC6）在肾癌组织中的表达,并探讨BIRC6沉默对786-O细胞凋亡和自噬的影响。方法 收集2016年2月~2018年12月梅州市人民医院肾癌手术切除标本20例,通过免疫组化检测BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达水平。将肾癌786-O细胞分为两组,对照siRNA组和BIRC6 siRNA组;通过lipofectamine 2000将BIRC6小干扰RNA（BIRC6-siRNA）及其对照siRNA（con-siRNA）转染到肾癌786-O细胞,Western blot检测转染后BIRC6蛋白表达水平,CCK8和流式细胞术分别检测BIRC6-siRNA和5-FU人肾癌786-O细胞活力和凋亡的影响,Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin和LC3A/B的表达水平。结果 免疫组化结果显示BIRC6蛋白在肾癌组织中的表达显着高于正常肾组织,转染BIRC6-siRNA后786-O细胞的BIRC6蛋白表达水平显著降低。12.5、25、50、100和200 μg/mL的5-FU诱导786-O细胞后,BIRC6-siRNA组细胞增殖抑制率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;流式检测结果显示,BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞凋亡率显著高于con-siRNA组,差异具有统计学意义（P<0.01）;BIRC6-siRNA组肾癌786-O细胞Beclin和LC3A/B蛋白表达显著低于con-siRNA组。结论 siRNA干扰BIRC6能够抑制肾癌786-O细胞自噬,促进5-FU诱导的细胞凋亡,促进肾癌786-O细胞对5-FU的敏感性。     

Reversal of multidrug resistance in renal cell carcinoma by short hairpin RNA targeting MDR1 gene

目的 研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）对肾癌细胞多药耐药基因(MDRl)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对化疗药物敏感性的变化。方法 根据MDRl基因设计3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列,在质粒的介导下转染肾癌A498细胞,RT-PCR法分析转染前后MDR1 mRNA表达水平,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆,Western bolt法检测MDR1蛋白表达水平,MTT法对比干扰前后多种化疗药物对细胞半抑制浓度（IC50）的变化;相关数据统计通过SPSS10.0软件进行。结果 3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDRl基因,使MDRl mRNA表达水平下降;筛选出的稳转细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降,并使多种化疗药物对细胞的IC50明显降低。结论 RNAi技术可有效抑制肾癌A498细胞MDRl基因的表达,并可显著增加其对多种化疗药物的敏感性,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。     

肾癌缺氧诱导因子2小干扰RNA表达载体的构建及筛选

目的:构建肾癌缺氧诱导因子2(HIF-2)小干扰RNA真核表达载体.并研究其对肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白表达的影响.方法:根据GenBank数据库提供的HIF-2基因核苷酸序列,选择设计双链小干扰RNA,合成HIF-2 RNAi片段No 1、No 2、No 3和对照片段,将RNAi片段定向克隆于pSilencer 2.1-U6 neo真核表达载体,转化感受态菌.挑取阳性载体克隆,DNA测序进行鉴定;培养人肾癌786-0细胞,在脂质体的介导下分别将No 1、No 2、No 3和埘照片段重组载体转染人人肾癌786-0细胞,并设未转染组,Western Blot法检测各载体对肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白表达的影响.结果:构建的HIF-2 RNAi真核表达载体经DNA测序证实与设计完全一致,转染肾癌786-0细胞24 h后,No 1组、No 2组和No 3组HIF-2蛋白表达水平降低(分别为0.05±0.00、0.11±0.01、0.15±0.01),与未转染组(0.22±0.02)和对照组(0.21±0.01)相比,差异有统计学意义(F=83.85,P<0.05);未转染和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).结论:成功构建人肾癌HIF-2RNAi真核细胞表达载体,并可有效干扰肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白的表达.     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

BTG1在HK-2和786-O细胞株中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的：探讨B细胞易位基因1（ BTG1）在人肾小管上皮细胞株（ HK-2）和肾透明细胞腺癌细胞株（786-O）中的表达及BTG1基因对HK-2和786-O细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用Western blotting方法检测BTG1蛋白在HK-2、786-O细胞株中的表达,构建BTG1表达质粒转染786-O细胞,合成BTG1干扰RNA转染HK-2细胞,通过流式细胞仪（ FACS）观察BTG1对HK-2、786-O细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：Western blotting检测显示,BTG1蛋白在HK-2中的表达高于786-O。786-O中高表达BTG1蛋白能够促进其凋亡,增加其G0/G1期比率;HK-2中低表达BTG1蛋白能够抑制其凋亡,减少其G0/G1期比率。结论：BTG1可能通过对细胞凋亡及细胞周期的调控抑制肾细胞癌的生长。     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达的实验研究

目的研究用RNAi表达载体对胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC一1,RT-PCR初步分析干扰载体对survivin表达地抑制情况。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与genebank中公布的一致,干扰载体si-svv-2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率达71％。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达。     

舒尼替尼调控miR-143对人肾癌细胞增殖、侵袭的影响

目的:探讨miR-143在肾癌细胞中的作用、舒尼替尼对miR-143表达的影响及与细胞增殖、侵袭的关系.方法:培养人肾癌786-O细胞株,分为对照组、miR-143组、舒尼替尼组、共同作用组.对照组细胞转染阴性对照序列,miR-143组细胞转染miR-143序列,舒尼替尼组细胞用舒尼替尼处理48 h,共同作用组细胞转染...     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的构建RNAi表达载体,并分析其对胰腺癌细胞PANC-1 survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达,并把survivin基因克隆到T载体进行测序,构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1,RT-PCR、western-blot分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达,其基因序列与GenBank中公布的一致,干扰载体pTZU6＋1-svv2可以有效的抑制survivin的表达,抑制率约为74％,并诱导了肿瘤细胞的凋亡。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达并诱导胰腺癌细胞凋亡。     

靶向survivin基因的RNAi诱导喉癌Hep 2细胞凋亡的研究

目的通过构建RNAi表达载体,转染喉癌细胞株Hep 2,观察其对survivin表达的抑制作用。方法构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体转染喉癌细胞Hep 2,分析干扰载体对survivin表达的抑制情况,检测细胞凋亡。结果survivin在喉癌细胞Hep 2中呈高表达,其基因序列与GenBank序列对比一致,干扰载体pGensil/survivin能抑制survivin的表达,抑制率为68%,并诱导了喉癌细胞的凋亡。结论针对survivin的小分子RNA可以有效抑制喉癌细胞Hep 2中survivin蛋白的表达,并促进喉癌细胞凋亡。     

姜黄素对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对肾癌786-O细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)表达水平以及细胞凋亡的影响,研究姜黄素对肾癌细胞的生长抑制作用并探讨其分子机制,进一步揭示姜黄素对肾癌的治疗作用。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌786-O细胞24、48、72 h后,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素对人肾癌786-O细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;免疫细胞化学检测姜黄素对786-O细胞HIF-1α和XIAP表达的影响。结果姜黄素对人肾癌786-O细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞48 h后,HIF-1α和XIAP蛋白表达量下降。结论姜黄素通过下调HIF-1α和XIAP的表达抑制人肾癌786-O细胞的增殖,诱导人肾癌786-O细胞的凋亡。