Gax基因转染对低氧性PASMCs增殖及原癌基因表达的影响

目的： 探讨生长终止特异性同源盒Gax基因转染对低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中原癌基因c-fos、c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响。方法：腺病毒介导Gax基因(Ad-Gax)转染PASMCs。在常氧（21％O₂）和低氧（2.5％O₂）12 h条件下，利用RT-PCR和免疫细胞化学法分别测定转染组和未转染组PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达，以及c-fos、c-jun mRNA表达变化；［³H］-TdR掺入法检测各组PASMCs增殖情况。结果：RT-PCR和免疫细胞化学法证实Gax基因转染后PASMCs中Gax能稳定过表达；转染组细胞c-fos、c-jun mRNA表达水平在常氧和低氧均低于未转染组细胞（P<0.05,P<0.01）；未转染组低氧时［³H］-TdR掺入量比常氧时高（P<0.01）；在常氧和低氧时转染组［³H］-TdR掺入量均低于未转染组（P<0.05，P<0.01）。结论：Gax基因过表达可能通过下调c-fos、c-jun基因的表达来抑制低氧性PASMCs的增殖。     

脱氧核酶抑制人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）基因特异性的10-23脱氧核酶（DNAzyme）对人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）增殖的影响。 方法： 设计合成针对PCNA基因起始密码AUG的DNAzyme，应用脂质体转染法将其转入体外培养的HUASMC。检测DNAzyme干预HUASMC 2 d后［3H］-TdR的掺入量；通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法分析HUASMC的增殖；采用流式细胞仪检测细胞周期。 结果： 1.0 μmol/L DNAzyme干预HUASMC 2 d后，［3H］-TdR的掺入量低于对照组（P<0.05）。1.0 μmol/L的DNAzyme和反义寡聚核苷酸（ASODN）组处理2、3和5 d后，MTT比色吸光度值低于对照组（均P<0.01）。DNAzyme对细胞增殖的抑制呈剂量依赖性。细胞干预2 d后，DNAzyme、ASODN和对照组的G0/G1期细胞的比率分别为73.8%、54.7%和41.1%。 结论： 针对PCNA的DNAzyme能有效抑制HUASMC的体外增殖。     

SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响

目的：探讨SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响。 方法： 以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs，G418筛选阳性克隆，应用免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3蛋白表达；缺氧处理转染组和对照组PASMCs，采用半定量RT-PCR检测转染前后常氧组、缺氧培养2 h、6 h、12 h、16 h、24 h细胞c-myc mRNA表达水平变化；［3H］-TdR掺入法检测转染前后上述各时点细胞增殖情况。 结果： 免疫细胞化学法证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达；半定量RT-PCR结果显示，SOCS3基因转染组细胞c-myc mRNA表达水平在缺氧各时点均显著低于同时点对照组细胞（P<0.01）；SOCS3基因转染组细胞在常氧和缺氧各时点［3H］-TdR掺入量显著低于对照组细胞（P<0.01）。 结论： SOCS3蛋白可能通过下调c-myc基因表达从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖。     

罗格列酮对胰岛素诱导的兔血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察罗格列酮对胰岛素诱导的兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:以组织块法原代培养兔胸主动脉血管平滑肌。采用细胞计数法测定细胞增殖，［3H］-TdR掺入法反映细胞DNA累积合成量。用RT-PCR方法测定蛋白激酶C mRNA含量。结果:罗格列酮对正常生长的细胞数目和掺入量无明显影响，与胰岛素组相比，1、5和10 μmol/L罗格列酮减少细胞数目分别为39.8%、46.9%和57.9%（P<0.01）；减少［3H］-TdR掺入量分别为29.6%、43.4%和53.8%（P<0.01）；对胰岛素诱导的a-PKC的表达上调无明显影响。结论:罗格列酮呈剂量依赖性抑制胰岛素诱导的平滑肌细胞的增殖。。     

半边莲生物碱抑制内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：探讨半边莲生物碱(LCLA)对内皮素-1（ET-1）诱导人脐动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的抑制效应及其作用机制。 方法： 采用细胞计数、［3H］-TdR掺入、流式细胞术、免疫细胞化学染色及Fura-3/AM 荧光探针标记方法检测VSMC增殖；并用台盼蓝拒染、乳酸脱氢酶（LDH）检测方法观察LCLA对VSMC的毒性反应。 结果： LCLA(100、200和400 mg/L)、BQ-123(10-6mol/L)、ST(10-7mol/L)均抑制ET-1所诱导的VSMC增殖（均P＜0.05）：明显降低VSMC的细胞数目、［3H］-TdR掺入量、S期和G2/M期的数目百分比，增加G0/G1期的数目百分比；减弱细胞内增殖细胞核抗原（PCNA）的表达强度和Ca2+荧光强度；LCLA的抑制作用存在明显的剂量依赖关系，但对VSMC存活率和LDH释放量均没有影响。 结论： LCLA浓度依赖性地抑制ET-1所诱导的人脐动脉VSMC增殖，其机制与降低VSMC内Ca2+含量有关。     

表皮生长因子对传代培养的大鼠生长板软骨细胞增殖与胶原合成的影响

目的：探讨不同浓度的表皮生长因子（EGF）对传代培养的大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）增殖和胶原合成的影响。 方法： 分离、培养RGC，分别用Western blot和阿尔新蓝（Alcine blue）染色检测各代RGC中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达；用［³H］-TdR和［³H］-proline掺入分别检测1、10和100 μg/L EGF对第1、3和5代RGC增殖和胶原合成的影响。 结果： 原代培养的RGC表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖，从第4代起Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达迅速降低，RGC发生了去分化。［³H］-TdR掺入表明，EGF促进第1代RGC的增殖（P<0.01），3个浓度的作用依次为：1 μg/L>10 μg/L>100 μg/L，差异显著（P<0.01）；3个浓度的EGF对第3代RGC保持了相近的促增殖作用（P<0.01）；对第5代RGC均无促增殖作用(P>0.05)。与促增殖作用不同，不同浓度EGF促不同传代的RGC的［³H］-proline掺入率比对照组均高20%左右（P<0.01）。 结论： EGF具有促进培养RGC增殖和胶原合成的作用，连续传代引起的去分化降低了RGC对EGF促增殖作用的反应，但对EGF的促胶原合成作用没有产生影响。     

肾上腺髓质素2对大鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响

目的：研究肾上腺髓质素2（AM2）对大鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响。 方法： 分离并培养SD大鼠脑微血管内皮细胞，经Ⅷ因子相关抗原的抗体鉴定和常规处理后，随机分为对照、AM2（10^-7 mol/L、10^-8 mol/L和10-9 mol/L）、ADM、ADM+AM2、10%胎牛血清和10％胎牛血清＋AM2 10-7 mol/L等8组，以［3H］-TdR掺入法测定MEC增殖反应。 结果： 10^-7-10^-9 mol/L各浓度AM2、ADM以及AM2和ADM合用对于静止状态的脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入与对照组比较均无明显差异（均P>0.05）。10%胎牛血清刺激组脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入比对照组高87.5%（P<0.05），10^-7mol/L AM2抑制胎牛血清诱导的脑微血管内皮细胞［3H］-TdR掺入增加（P<0.05）。 结论： AM2抑制血清诱导的脑微血管内皮细胞增殖。     

慢性代谢性酸中毒显著诱导大鼠系膜细胞的增殖

目的：研究慢性代谢性酸中毒对大鼠肾小球体积、系膜细胞增殖、基质表达的影响及分子机制。 方法： 采用0.28 mol/L NH4Cl喂饲大鼠构建大鼠慢性代谢性酸中毒模型。采用光镜结合图像分析软件观察和分析大鼠肾小球结构。从肾皮质分离大鼠肾小球，肾小球增殖细胞核抗原(PCAN)和p27的表达采用免疫组化和/或Western blotting检测。肾皮质纤维连接蛋白(FN)ｍRNA的表达采用荧光定量RT-PCR检测。分别采用［3H］-TdR掺入法和ELISA方法检测了慢性酸负荷对体外培养的大鼠系膜细胞增殖及FN合成的影响。 结果： 各时点实验组大鼠动脉血pH、［HCO3-］均显著低于对照组(P<0.01)。第3、7、14 d实验组大鼠肾重及肾/体重比值均显著大于对照组，而绝对体重与对照相比无显著差异；平均肾小球面积、肾小球丝球体面积、球内细胞总数以及系膜区细胞数均大于对照组（P<0.05），第14 d大鼠肾小球系膜区面积与肾小球丝球体面积比值高于对照组（P<0.05）；第3、7、14 d Western blotting检测实验组大鼠肾小球PCNA表达增加，p27表达下调，免疫组织化学检测显示肾小球内阳性PCNA细胞主要位于系膜区；第7 d、14 d大鼠肾皮质FN mRNA的表达显著高于对照组（P<0.01）。体外系膜细胞［3H］-TdR掺入量随酸负荷强度而增高，酸负荷24 h和48 h，系膜细胞上清中FN含量显著增高。 结论： 慢性代谢性酸中毒能够诱导大鼠肾小球肥大、系膜细胞增生及细胞外基质增多，其机制与系膜细胞周期调控蛋白P27的表达下调有关。本研究为慢性代谢性酸中毒参与慢性肾小球疾病的硬化提供了体内和体外证据。     

Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs增殖、凋亡的影响及与MAPK通路的关系

 目的：探讨电压依赖性钾离子通道Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖、凋亡的影响及其与丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法：体外培养大鼠PASMCs,复制低氧高二氧化碳模型,随机分组如下：常氧组（N组）;低氧高二氧化碳组（HH组）;低氧高二氧化碳+溶剂DMSO对照组（HD组）;低氧高二氧化碳+ERK1/2通路抑制剂U0126组（HU组）;低氧高二氧化碳+p38 MAPK通路抑制剂SB203580组（HS组）;低氧高二氧化碳+MAPK通路激动剂茴香霉素（anisomycin）组（HA组）。采用CCK-8法检测细胞活性,蛋白免疫印迹法检测Kv1.5、增殖细胞核抗原（PCNA）及Bax蛋白的表达水平。结果：与N组相比,HH组和HD组细胞活性增加（P<0.01）,PCNA蛋白表达上调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显降低（P<0.01）,HH组和HD组间各指标变化均无显著差异（均P>0.05）;较之HD组,HU组、HS组及HA组细胞活性降低（P<0.05或P<0.01）,PCNA蛋白表达下调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显增加,差异均显著（P<0.01）,其中以HA组各指标变化最明显。结论：钾离子通道Kv1.5对低氧高二氧化碳性大鼠PASMCs增殖、凋亡的调节可能与MAPK通路的激活有关。     

HO通过减少ROS生成抑制AngⅡ的致血管平滑肌细胞增殖肥大

目的:观察血红素加氧酶（HO）在AngⅡ致血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和肥大中的作用并探讨其可能机制。方法:（1)免疫印迹法测定平滑肌细胞HO-1蛋白表达水平;（2）β-液体闪烁记数仪测定［3H］-TdR和［3H］-亮氨酸掺入量;（3)乙酰乙酸双氯荧光素（DCFH-DA）法测定平滑肌细胞内活性氧（ROS）水平。结果:（1) Hemin组HO-1蛋白表达水平与对照组和AngⅡ组相比均明显升高（P<0.01）。（2）AngⅡ使血管平滑肌细胞［3H］-TdR和［3H］-亮氨酸掺入量较对照组分别升高20.7％和18.0％（P<0.01）,而给予HO底物Hemin则抑制了［3H］-TdR和［3H］-亮氨酸掺入量的增加, 给予HO的抑制剂ZnPPIX则可以促进AngⅡ所致的［3H］-TdR、［3H］-亮氨酸掺入量的增加。(3) AngⅡ组ROS水平明显高于对照组（P<0.01）;Hemin组ROS水平较AngⅡ组降低了62.7％,而ZnPPIX组高于AngⅡ组39.5％。结论:HO可抑制AngⅡ所导致的VSMCs的增殖和肥大,其机制可能与减少细胞内ROS生成有关。     

钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。应用Western blotting技术及免疫荧光染色分析CaSR蛋白在肺动脉平滑肌的表达;采用激光共聚焦扫描技术检测不同处理因素对细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,应用MTT法分析不同处理因素对细胞存活率的影响。结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞有CaSR蛋白表达。缺氧能够增加CaSR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞存活率及[Ca2+]i(与对照组比较,P0.05)。GdCl3(CaSR激动剂)能够增强缺氧的上述作用,NPS2390(CaSR抑制剂)则能够减弱缺氧的作用。结论:缺氧诱导的CaSR表达增加参与了缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖。     

抑制肌球蛋白轻链激酶活性对内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡失衡的影响

目的:观察抑制肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖与凋亡失衡的影响。方法:细胞分成3组:对照组;内皮素-1组;内皮素-1+肌球蛋白轻链激酶抑制剂组(ET-1+M组)。干预72 h后,免疫印迹法测定细胞内MLCK表达水平;甘油凝胶电泳和免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平,MTT比色法及[3H]-TdR掺入法检测PASMCs的增殖情况,流式细胞仪检测PASMCs的细胞周期变化及凋亡率。结果:同对照组比较,ET-1刺激后肺动脉平滑肌细胞MLCK蛋白表达显著增强、MLC磷酸化上调、增殖增多、凋亡率明显降低(均P0.05);加入MLCK抑制剂干预后,MLCK表达明显下降(P0.05)、MLC去磷酸化显著增强、逆转了ET-1对PASMCs增殖及凋亡的影响。结论:抑制MLCK能显著逆转内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的失衡。     

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究红景天甙(Salidroside,Sal)对低氧(3%)条件下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入试验、Fluo-3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca²⁺浓度等方法。结果:低氧24h可直接刺激PASMC,使MTT的A值增加62%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量增加138%(P＜0.01)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal(32×10^-5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用,与低氧组相比MTT的A值下降29%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降37%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用,与低氧组相比较,MTT的A值下降23%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降51%(P＜0.01)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca²⁺浓度明显增加(P＜0.05),Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca²⁺浓度的上升。结论:红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca²⁺浓度增加有关。     

钙敏感受体通过PI3K信号通路介导缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的:探讨钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖中的信号转导途径。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠PASMCs。通过缺氧培养箱内(93%N₂、2%O₂、5%CO₂)培养24h的方法复制细胞缺氧模型。应用Western blotting分析不同处理情况下细胞周期素D1(cyclin D1)及磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)在PASMCs中的表达;采用流式细胞术检测不同处理因素对细胞增殖周期及增殖指数的影响,应用BrdU掺入法分析不同处理因素对细胞DNA合成的影响。结果:缺氧引起PASMCs的cyclin D1及p-Akt表达水平上调,增加BrdU掺入量、S期细胞数量和细胞增殖指数,GdCl₃能够放大缺氧的作用,但上述效应可以被LY294002抑制。结论:CaSR通过PI3K/Akt信号通路参与缺氧诱导的大鼠PASMCs增殖。     

瓜蒌注射液对兔血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察瓜蒌注射液对血管平滑肌细胞(SMC)增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:用免疫组织化学LSAB法检测培养的兔主动脉SMC中PCNA的表达,液闪法测定SMC氚-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入量,同时测定培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、前列环素(PGI₂)及环磷酸腺苷(cAMP)的含量。结果:瓜蒌注射液能增加SOD活性,降低LPO和升高PGI₂、cAMP水平,抑制SMC的[³H]-TdR掺入量和PCNA的表达(P均＜0.05,0.01)。结论:瓜蒌有抑制SMC增殖的作用。     

金属硫蛋白抑制同型半胱氨酸诱导的大鼠血管成纤维细胞激活

目的:观察外源性金属硫蛋白(MT)和ZnCl₂诱导内源性MT生成对同型半胱氨酸(HCY)激活大鼠血管成纤维细胞增殖的影响, 以探讨MT拮抗HCY血管损伤的可能机理。方法:采用[³H]-胸腺嘧啶([³H]－TdR)和[³H]-脯氨酸([³H]－Pro)掺入法测定细胞增殖及胶原生成, 自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量, 台盼蓝排斥法计算细胞存活率, 并用[¹⁰⁹Cd]-血红蛋白饱和法检测细胞MT的含量。结果:HCY50、100、500μmol/L呈浓度依赖性刺激血管成纤维细胞增殖, 胶原合成和分泌(P＜0.05或P＜0.01), 500μmol/LHCY使细胞LDH漏出量增多, 细胞存活率降低。MT1×10^-5mol/L、1×10^-4mol/L与500μmol/LHCY共孵育组与单纯HCY组比较, [³H]-TdR、[³H]-Pro掺入、胶原分泌降低, LDH漏出量减少(P＜0.05或P＜0.01)。ZnCl₂预处理诱导细胞MT含量增加(P＜0.05), 而ZnCl₂处理与HCY50、100、500μmol/L共孵育组[³H]－TdR和[³H]－Pro掺入, 胶原分泌、LDH漏出量都明显低于单纯HCY组细胞, 且细胞存活率高于单纯HCY组(P＜0.05或P＜0.01)。结论:HCY刺激血管成纤维细胞增殖与胶原合成, MT无论外源应用或内源性诱导生成均能有效拮抗HCY的上述作用。MT对HCY作用的拮抗效应可能是其血管细胞保护的机理之一。