人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学鉴定

目的：建立体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，描述MSCs的生物学特征，探索MSCs作为组织工程种子细胞的可行性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法，分离纯化大鼠MSCs。利用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14、CD29、CD34、CD45、CD105的表达率。取第4代MSCs进行成骨、成脂肪、成软骨诱导分化，观察细胞的形态变化情况，在诱导第14d进行茜素红染色和油红染色以检测MSCs是否分化成骨和脂肪细胞；在诱导第21d用阿新蓝染色法检测MSCs是否分化成软骨细胞。结果：从骨髓分离获得的MSCs为体积小、核浆比大、呈旋涡状生长的梭形细胞。第3代细胞表面标记物阳性率分别为CD14：0．67％，CD29：94．5％，CD34：0．72％，CIM5：0．39％，CD105：86．36％。MSCs在相应的诱导条件下，分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法可分离出较纯的MSCs，经扩增培养后获取足够数量的MSCs，能满足组织工程的需要。MSCs具有多向分化的潜能，可在体外诱导分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，具有广阔的应用前景。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定

目的:建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs具有多项分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及荧光标记的实验研究

目的建立一种分离纯化,培养扩增、荧光标记骨髓间充质干细胞的方法,为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用荧光活性杂料CM-Dil标记。结果分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养9代,未发生形态学改变,无衰老征象;CM-Dil标记后,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后呈红色荧光,DIL标记阳性率为100%,标记的骨髓MSCs呈梭形,保持了良好的形。结论采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,以获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效使用可行的方法;CM-Dil是一种简洁、有效的标记骨髓MSCs的方法。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

兔外周血间充质干细胞生物学性状的研究

目的应用G—CSF动员骨髓干细胞后分离外周血间充质干细胞（MSCs）,并体外培养扩增然后进行鉴定。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周血MSCs,并用显微镜观察细胞形态,测定细胞的生长曲线并用流式细胞仪鉴定。结果@MSCs于体外培养2h开始贴壁生长,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃,细胞平均倍增时间为30h;②流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD34、CD45呈阴性表达,CD44呈阳性表达。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G—CSF动员后的外周血MSCs,且细胞纯度高,生长增殖活性好。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学活性观察

目的建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增的方法，并进行生物学活性观察。方法穿刺抽取新西兰大耳白兔骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用矿化液连续培养后，进行ALP及矿化结节染色。结果体外成功建立兔骨髓间充质干细胞分离扩增传代的方法，能够连续传至8～9代；矿化液培养的细胞ALP及矿化结节染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养，具有向成骨细胞诱导分化的特性，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

Sertoli细胞的培养及其对生精细胞支持作用的研究

本文培养幼龄大鼠Sertoli细胞,培养1周细胞纯度达95％以上,3周细胞仍保持止常形态。生精细胞和Sertoli细胞混合培养及Sertoli细胞条件培养液培养生精细胞,结果表明Sertoli细胞可通过和生精细胞在接接触及分泌调节物质对生精细胞的体外存活、增殖、分化等起着支持作用。     

自制爬片装置用于细胞爬片及细胞染色

目的利用自制爬片装置改进细胞爬片的制备方法。方法通过自制装置和传统方法制备细胞爬片,苏木精- 伊红染色法（HE 染色）观察细胞生长状态,比较两种细胞爬片制备方法的差异;利用自制装置制备同时给予3 种不同干预处理的细胞爬片,验证其应用于制备多干预条件细胞爬片;制备同时含有3 种不同细胞的集成爬片,验证其用于制作细胞集成爬片的应用。结果自制装置可简化细胞爬片流程,细胞直接贴于载玻片上生长,未出现污染和增殖受限,制作多干预或多种细胞集成爬片效果明确,无相互干扰现象。结论自制装置能更简便地制备以满足普通染色及特殊染色实验要求的细胞爬片,是一种更好的制备细胞爬片的方法。     

大鼠肝星状细胞的分离培养鉴定

目的改良分离培养大鼠肝星状细胞的简便方法。方法经过门静脉插管、推注肝素稀释液、肝脏灌流、胶原酶离体循环消化、过滤、离心分离等步骤,分离肝星状细胞,省去了链霉蛋白酶E消化过程,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果每只鼠肝HSCs的得率为0.5~1.0×107,纯度为(92.2±2.0)%,活率为(97.8±0.3)%,数量及活率均符合实验要求。结论该方法简便、廉价、实用,值得进一步探索。     

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法。方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化;细胞接种18 h时,倒置显微镜下观察细胞生长情况;将细胞转入新的培养板培养,定期收集培养液上清。分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平。结果SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少,双硫腙可染率85%~90%,锥虫兰染色细胞活力90%以上,培养7~11 d的细胞分泌功能正常。结论用胶原酶反复短时间消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞。     

兔骨髓诱导的内皮细胞和纤维蛋白凝胶体外共培养

目的将兔骨髓诱导的内皮细胞接种于纤维蛋白凝胶内并观察其生长增值情况。方法梯度离心分离兔骨髓单个核细胞（MNCs）,直接向内皮细胞诱导培养,传代培养至第2代细胞,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,免疫组化鉴定;以10^5密度接种于纤维蛋白凝胶中培养并定期观察细胞生长情况,单纯细胞及胶原内的细胞分别用MTT法检测其生长并绘制生长曲线,胶原切片并作苏木精．伊红染色观察细胞在胶原内的生长。结果诱导的内皮细胞为铺路石样。呈单层生长,第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性;细胞在纤维蛋白凝胶内成立体生长,细胞在纤维蛋白凝胶内3d后成梭形铺开,6d后自发形成管腔样结构;细胞在纤维蛋白凝胶内生长曲线成“s”形。结论骨髓诱导的内皮细胞在纤维蛋白凝胶内生长增值良好,纤维蛋白凝胶可以作为接种骨髓诱导的内皮细胞的基质材料。     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

芹菜素对大鼠生精细胞凋亡作用的影响

目的研究芹菜素对大鼠生精细胞凋亡的影响。方法应用percoll不连续密度梯度分离培养大鼠睾丸生精细胞,应用流式细胞术观察芹菜素对生精细胞凋亡的影响。结果芹菜素作用于大鼠生精细胞,FCM分析显示芹菜素能促进生精细胞凋亡,并呈剂量依赖方式。结论芹菜素能呈剂量依赖式促进睾丸生精细胞凋亡。     

器官培养在研究人食管上皮癌变中的应用

将组织块置于明胶海绵上,摇摆器官培养,4～6周后成人食管粘膜仍保持良好的结构形态,具有活跃生长的上皮细胞和良好的腺体结构;将组织块贴壁,静置外植块—细胞培养,成人食管粘膜和胎儿食管组织块可存活2～3个月,提供大量生长旺盛的上皮细胞。成人食管癌旁粘膜培养利于观察细胞癌前改变,可能较易于诱发癌变;胎儿食管具有正常背景,利于研究细胞癌变的全过程.二者配合可组成研究人食管上皮癌变的完整体外实验系统。     

人胚胎皮层神经前体细胞的分离培养及鉴定

目的 从20周人胚皮层中分离神经前体细胞并鉴定其增殖及分化能力。方法 应用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清限制培养基从20周自然流产人胚胎皮层组织中分离神经前体细胞,通过神经球形成法使其不断增殖,利用BrdU检测细胞的增殖能力,去除生长因子后诱导神经前体细胞分化。利用流式细胞仪检测神经球内细胞的增殖细胞周期。结果 人胚胎皮层存在神经前体细胞,这些细胞于EGF及bFGF作用下可不断增殖形成神经球,并能自我更新和结合BrdU,于生长因子去除后能够分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。反复传代后这些细胞可保持其增殖及分化能力。细胞周期结果显示神经球内细胞增殖较为活跃。结论 从人胚胎中分离的细胞能于体外自我更新和分化为成熟的细胞,证实为神经前体细胞。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.