香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:研究香丹注射液对成年SD大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的诱导分化作用.方法:rMSCs取自大鼠的下肢骨,贴壁筛选法和营养缺陷培养基(α-MEM完全培养液)分离纯化.加碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导第5代的rMSCs 24 h,换无血清培养液(D/F12 N2 bFGF)和香丹注射液(1%～5%)诱导6～8 h,观察细胞形态变化;细胞免疫化学和反转录-PCR法鉴定神经元标记物(神经元特异性烯醇化酶NSE、神经丝蛋白NF-200、微管相关蛋白MAP-2及胶质纤维酸性蛋白GFAP)的表达及相对表达量,并得到相应的诱导率.结果:诱导3 h,rMSCs出现神经元样的形态学变化,诱导6～8h,神经元的诱导率达83.5%±3.8%;诱导组中,神经元样细胞NSE、NF和GFAP的阳性率分别为82.9%±2.98%、84.1%±4.45%、3.49%±1.67%;对照组细胞和诱导组未变化细胞上述染色均呈阴性;RT-PCR法示:只有诱导组有NSE、MAP-2(HWM)、GFAP的表达且前两者的表达量均分别高于后者(P＜0.01).结论:1%～5%香丹注射液在体外能定向诱导rMSCs分化为神经元样细胞.     

黄芩甙拮抗大鼠神经元和星形胶质细胞氧应激损伤

目的 探索过氧化氢(H2O2)致星形胶质细胞损伤的实验条件,研究黄芩甙对大鼠神经元和星形胶质细胞氧应激损伤的保护作用。方法 体外培养大鼠前脑星形胶质细胞和神经元,分别应用H2O2、黄芩甙及两者联用处理,应用MTT分析法测定细胞活力或存活率。结果 不同浓度H2O2对星形胶质细胞存活率的影响各组间差异有显著性(F=28、569,P<0．01)。同一浓度的H202对不同接种密度细胞的损伤程度不同(F=5．439,P<0．01)。在2．5～40μmol／L浓度范围内,黄芩甙不影响各组神经元和星形胶质细胞的存活率(神经元,F=0．49,P>0．05;星形胶质细胞,F=1．001,P>0.05)。但黄芩甙对H202所致神经元和星形胶质细胞氧应激损伤有拮抗作用(神经元,F=24．384,P<0．01;星形胶质细胞,F=5．000,P<0．01),黄芩甙浓度越高,则细胞存活率越高。结论 构建了一个H202氧化损伤星形胶质细胞的模型。在2．5～40μmol／L浓度范围内,黄芩甙对神经元和星形胶质细胞均无毒性作用。但黄芩甙能够拮抗H202所致的神经元和星形胶质细胞氧化损伤,而且这种作用呈剂量依赖性。     

人参总皂苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨人参总皂苷体外诱导青年SD大鼠骨髓问质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法贴壁筛选法分离纯化MSCs.10μg?L-1bFGF预诱导第5代的MSCs 24h,换200μg·mL-1人参总皂苷的无血清培养液诱导诱导5～6h,观察细胞形态变化,免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果第5代间质干细胞形态达到均一,呈梭形.用人参总皂苷诱导30min到3h后,MSCs胞体逐渐增大,并伸出细长突起形似神经元样细胞.诱导5～6h后.NSE、MAP-2和GFAP阳性细胞数分别为(76±4.7)%、(61±5.2)%、(10±2.4)%.对照组上述染色均呈阴性.结论人参总皂苷在体外能定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

叶酸诱导骨髓基质干细胞分化为神经细胞的浓度探索

目的探讨叶酸对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的最佳浓度。方法MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁离心获得．取第5代MSCs以1mmol／L二巯基乙醇（BME）预诱导24h后,用羟基茴香醚（BHA）、2％二甲基亚砜（DMSO）和3种不同浓度的叶酸诱导分化,采用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白GFAP的表达,MTT（四唑盐比色）法检测不同时间段对BMSCs增殖的影响。结果不同剂量叶酸组分化为NSE阳性神经元样细胞的百分率都较对照组高（P〈0．01）,但以40mg／L中等浓度的叶酸神经细胞最多,且神经元比例高于其他组。结论叶酸诱导BMSCs向神经元分化以40mg／L浓度为最佳。     

三七总皂苷对人骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的 研究三七总皂苷（tPNS）与bFGF联合在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分化为神经元样细胞过程中的诱导作用及作用剂量.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增、纯化hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表面CD29、CD44、CD105、CD34分子,测定周期.取第三代hBMSCs,含20%胎牛血清的1 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）预诱导24 h,继而用bFGF（20 ng/mL）标准组、tPNS（1 mg/mL）药物组、20 ng/mL bFGF＋低、中、高剂量tPNS（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL）诱导液诱导,设立空白对照组.采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋-2（MAP-2）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达.MTT法检测各组诱导后不同时间点对神经元样细胞活力的影响.结果 成功分离培养hBMSCs,经诱导后大部分hBMSCs分化为神经元样细胞,联合诱导组细胞生长状态及活力较好,阳性细胞NSE、MAP-2比例高于对照组（P〈0.05）,GFAP表达阴性.结论 tPNS与bFGF联合在体外能有效诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞特异性抗原,保持较好的活力、延长存活时间.     

丹参素定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 研究丹参素体外定向诱导骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分化为神经元样细胞。方法 利用Ficoll-Paque液将骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达。采用含丹参素的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并且探讨丹参素不同浓度及不同作用时间对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响。以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、结果 MSC在体外传代扩增后,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD166表达阳性,CDl4、CD34、CD45、HLA-DR为阴性。丹参素诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出,呈典型的核周体形态,类似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论 丹参素可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参素浓度和作用时间有关。     

黄芪注射液联合间质干细胞对大鼠脊髓损伤修复作用的实验研究

目的研究黄芪注射液与间质干细胞联合应用对大鼠脊髓损伤修复的影响。方法Wistar大鼠120只随机分成假手术组、模型组、PBS液对照组、黄芪注射液对照组、大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)移植治疗组和rMSCs移植加黄芪注射液治疗组。造模后3 d治疗组经脊髓局部注射rMSCs和脊髓局部注射rMSCs同时加用黄芪注射液腹腔注射,对照组则分别注射PBS液和黄芪注射液。移植后7、14、21、28天分别行(Basso Beattie Bresnahan,BBB)评分法检测大鼠神经功能恢复情况,进一步取脊髓组织作病理学检查,并应用双标免疫组化检测5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记rMSCs的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元中丝蛋白(NF-M)表达情况。结果治疗组较对照组损伤脊髓修复明显,神经功能评分显著提高(P0.05)。rMSCs移植加黄芪注射液治疗组在不同时间点的神经功能评分都高于rMSCs移植治疗组。脊髓组织病理切片显示rMSCs移植加黄芪注射液治疗组较rMSCs移植治疗组组织水肿和炎性细胞浸润减轻更明显,胶质细胞增生更活跃。双标免疫组化显示移植的rMSCs在宿主脊髓中存活,从第7 d开始即有GFAP和NF-M表达并向损伤部位迁移。rMSCs加黄芪注射液治疗组中GFAP、NF-M阳性细胞数目均较rMSCs移植治疗组增多(P0.05)。结论rMSCs移植是治疗脊髓损伤的有效方法;黄芪注射液在体内有诱导rMSCs向神经细胞分化的能力,并有协同rMSCs促进大鼠脊髓损伤修复的作用。     

人参总皂苷对人胚胎神经干细胞增殖及定向诱导为多巴胺能神经元的影响

目的：探讨人参总皂苷(TSPG)对人胚胎神经干细胞(NSC)增殖和分化为多巴胺(DA)能神经元的影响。方法：从7～12周人工流产胚胎脑组织中分离培养人胚胎NSC,免疫细胞化学鉴定NSC特异性nestin抗原表达,在NSC的培养体系中加入TSPG,采用流式细胞术和MTT法检测不同浓度TSPG以及TSPG与EGF,bFGF联合应用对人胚胎NSC增殖的影响；经免疫细胞化学检测培养细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达,分析不同浓度TSPG以及TSPG与IL-1联合应用对NSC定向诱导为DA能神经元的影响。结果：TSPG对NSC的增殖有促进作用,TSPG与EGF、bFGF联合应用的促增殖作用是EGF和bFGF联合应用时的2倍；TSPG能促进神经干细胞定向分化为DA能神经元,TSPG与IL-1联合诱导的效果是单用IL-1的5倍。结论：TSPG能促进人胚胎NSC的增殖,并能诱导NSC向DA能神经元分化。     

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞定向分化的诱导作用研究

目的:研究黄芪注射液预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的定向诱导作用.方法:在无菌条件下从成年大鼠胫骨骨髓分离出MSCs,以1:3的比例传代,取第3代的细胞,接种后随机将MSCs分为5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组及对照组,用相差显微镜观察各组细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定MSCs表面标志物及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.结果:培养后的细胞表面CD44表达阳性;黄芪注射液诱导组、5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导分化组、黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组诱导后的细胞形态发生改变,细胞之间形成连接,排列方向趋于一致,免疫组化检测结果显示肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)表达均阳性,黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化组表达相对更强,与其他组相比有显著差异.结论:黄芪注射液可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,采用黄芪注射液预处理后5-Aza诱导分化的方式相对其他的方法更具优势.     

Effects of Salvia miltorrhiza in neural differentiation of rat mesenchymal stem cells with optimized protocol

Aim of the study

The present study was aimed to explore the effects of Salvia miltorrhiza in inducing rMSCs to differentiate into functional neurons.

Materials and methods

rMSCs were isolated and cultured in vitro, then Salvia miltorrhiza was added to induce rMSCs to differentiate repeatedly for 5 times with an optimized protocol, and neurophysiological functions such as action potential, endocytosis and exocytosis of the induced cells were investigated.

Results

About 98% of rMSCs expressed markers related to neural stem cells after treatment with preinduction medium, but they remained fibroform, the classical morphological state of MSCs, after exposure to induction medium for 2 h, and the induced cells showed a neural shape. Next, fetal bovine serum (FBS) was added into the induction medium, transforming the neuron-like cells into fibroform cells. Finally, after exposure to induction medium, the cells could be transformed into neuron-like cells again. After the procedure was repeated 5 times, the induced cells displayed a classical neural shape and more than 95% of them expressed neural markers, including TUJ-1, NF and synaptophysin. Furthermore, the induced cells displayed neurophysiological functions, as characterized by action potential, endocytosis and exocytosis in response to a solution with a high concentration of potassium (K⁺).

Conclusion

Salvia miltorrhiza can induce rMSCs to differentiate into neurons with neurophysiological functions efficiently by an optimized protocol.     

地黄多糖诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞最佳浓度探索

目的探讨地黄多糖对骨髓间充质干细胞（MSCs）诱导分化为神经细胞的最佳浓度。方法利用贴壁法分离纯化MSCs，不同浓度地黄多糖诱导其向神经细胞分化，β-巯基乙醇诱导作为对照，光镜下观察细胞形态，采用免疫细胞化学方法计算神经元和胶质细胞阳性数。结果不同浓度地黄多糖诱导培养24h后均可表现为典型的神经细胞样形态，但以中浓度地黄多糖组神经细胞数最多，且神经元比例高于其他两组。结论地黄多糖诱导MSCs分化为神经元以中浓度最佳。     

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液分离成人MSC，体外扩增，FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达，采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF－M，NF－H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（Nestin)的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10^6个细胞，15代可获得（2－3）×10^12个细胞，流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后，MSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF－M，NF－H、Nestin表达阳性，GFAP阴性。结论：隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的　黄芩甙体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞 ,体外扩增培养。中药黄芩甙定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (Nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果　大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄芩甙诱导 5h后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论黄芩甙可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

茶多酚体外诱导人肺癌细胞凋亡的机理研究

目的探讨茶多酚诱导人肺癌细胞的凋亡作用及其相关机理。方法采用MTT法、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪技术,体外观察茶多酚对肺癌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。结果不同浓度的茶多酚(50、100、200、400μg／ml)对肺癌细胞均有抑制作用,呈剂量依赖关系,抑制率(％)分别为28.69±1.27、46．19±1．79、64.61±1．29、75．90±1．96。在细胞增殖受到明显抑制时,细胞被阻滞于G0/G1期,不能进入S期及G2／M期,同时诱导肺癌细胞凋亡,凋亡率(％)分别为4.76±0．11、5．78±0．38、10.06±0．67、24．44±0．44。激光共聚焦显微镜双荧光标记可见细胞凋亡的形态学改变,与对照组比较,随着茶多酚浓度的增高,细胞内Ca^2+浓度、Annexin V表达和蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)蛋白表达逐渐增高,细胞周期调控蛋白D1蛋白表达水平则呈逐渐下降。结论茶多酚可诱导人肺癌细胞的凋亡,其作用机制与改变细胞内Ca^2+浓度、FTEN蛋白和Cyclin D1蛋白表达有关。