肉毒梭菌神经毒素检测技术的研究进展

肉毒神经毒素(BoNT)是迄今为止所发现的生物毒素中毒性最强的物质,能引起人和动物以松弛性麻痹为主症的肉毒中毒,同时也是最重要的生物毒素战剂和生物恐怖剂之一.研究和建立BoNT检测与鉴定方法具有十分重要的军事和医学意义.本文综述了近年BoNT检测与鉴定方法的研究进展.     

重组肉毒神经毒素A轻链(BoNT/A LC)蛋白的表达、纯化与鉴定

目的：克隆、表达并纯化肉毒神经毒素A轻链(BoNT／ALC)片段，为BoNT／A的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：以PCR方法自肉毒梭菌中扩增BoNT／A轻链基因，直接插入pGEM—T载体，测序正确后再与表达载体pET21a构建重组表达栽体pET21a-轻链，转化E.coli BL21(pLys)感受态细胞获得表达工程菌株并进行诱导表达，用Western印迹鉴定重组：BoNT／A轻链。结果：经PCR获得的：BoNT／A轻链序列与GenBank中的BoNT／A轻链基因序列的一致性达99．9％以上。表达工程菌BL21／pET21a—A LC于37℃：经0.7mmol／LIPm诱导6h，目的蛋白获得高表达，约占菌体总蛋白的23％。经过镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析一步纯化，重组BoNT／A轻链的纯度可达97％以上。Western印迹结果表明，重组BoNT／A轻链与抗天然：BoNT／A的马血清发生特异性的抗原抗体结合反应。结论：成功克隆、表达并纯化了：BoNT／A轻链片段，其抗原性良好。     

重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素E重链C端(BoNT／EHC2)保护性抗原片段，为BoNT／E的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：采用PCR扩增BoNT／EHc2基因，插入表达载体pET28a，转化E．coli BL2l(DE3)pLysS获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT／EHc2的抗原性。结果：表达工程菌pEq28a-EHC2／BL21(DE3)pLysS于37℃用0．2mmol／L IPTG诱导6h，表达的目的蛋白可以达到全茵蛋白的37．9％。经过固定化金属螯合亲和层析一步纯化，rBoNT／EHC2的纯度可达95％以上。Western印迹和间接ELISA显示其具有良好的抗原性。结论：首次克隆、表达并纯化了BoNT／EHC2片段，并可被抗天然BoNT／E马血清所识别，为制备相应的抗体及建立快速检测方法做好了准备。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B线性B细胞抗原表位的预测

目的：通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒（ human cytomegalovirus ,HCMV）包膜糖蛋白B （ glycopro－tein B,gB）的结构及理化特性,预测gB的线性B细胞抗原表位。方法基于HCMV gB的序列,利用两种在线B细胞表位预测程序及DNAstar软件对gB进行预测;利用SWISS－MODEL服务器同源构建gB三级结构模型,进行进一步验证。结果与结论综合多项分析,预测得到HCMVgB的多个线性B细胞表位,为后续验证其优势中和表位,建立富含高效价中和抗体的原料血浆的筛选方法奠定了基础。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型的构建及应用

目的 构建B型肉毒毒素轻链（BoNT/B,BLC）荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法 将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白荧光表达水平,利用Western印迹法检测细胞中BLC-EGFP的酶切活性和稳定性,进一步利用该模型评价SRC激酶抑制剂KX2-391对BLC-EGFP蛋白胞内稳定性的影响。结果 成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-BLC。质粒转染后,BCL-EGFP蛋白在Neuro-2a细胞中的表达水平随时间逐渐增加并具有酶切胞内底物囊泡相关蛋白-2(VAMP-2)的活性;质粒转染12 h后加入CHX终止蛋白合成,BLC-EGFP的胞内水平在72 h内无显著变化;加入KX2-391作用24 h后,可显著促进BLC-EGFP蛋白的胞内降解。结论 成功建立B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型,为后续B型肉毒毒素轻链胞内持留机制研究和胞内解毒剂筛选提供了技术储备。     

人水通道蛋白1的B细胞表位初步预测分析

目的分析人水通道蛋白1的B细胞优势表位,为后续研究获得其单克隆抗体做好铺垫。方法分别对人水通道蛋白1进行亲水性、二级结构、柔韧性、极性、可及性、电荷分布等多参数进行分析,然后用抗原性指数的方法综合分析。结果人水通道蛋白1的肽段21—39、39-45、42～49、79～93、110～125、122～128、130～138、153～164、229—237预测结果具有较高的免疫原性。结论多参数预测分析获得多个人水通道蛋白1表位多肽,为后续制备抗人水通道蛋白1单克隆抗体奠定了基础。     

肉毒杆菌食物中毒5例诊治分析

肉毒杆菌食物中毒目前在我国发病较少见,肉毒杆菌食物中毒亦称肉毒中毒,是因为进食含有肉毒杆菌（肉毒梭状芽孢杆菌）外毒素的食物而引起的中毒性疾病,临床上以神经系统症状如眼肌及咽肌瘫痪为主要表现。2009—12我院接诊了5位家族成员食用自制臭豆腐集体食物中毒,给予相应治疗后取得一些初步的经验,现报道如下。     

人角蛋白17的序列分析及辅助性T细胞表位预测

目的：本文对角蛋白17的序列和辅助性T细胞抗原表位进行了分析预测，为一定遗传背景下T细胞介导的自身免疫紊乱引发银屑病这一观点提供了研究基础。方法：以氨基酸组成、疏水性和亲水性分析以及氨基酸替换和二级结构分析的结果为参考，以mADR限制性预测方法为主，进行K17的辅助性T细胞表位综合预测。结果：与HLADR7相关的T细胞辅助性表位可能在5～15肽段、150～190肽段、270～300肽段和315～355肽段；与HLA DR4相关的T细胞辅助性表位可能在1～10肽段、50～70肽段、110～170肽段、270～350肽段和400～420肽段。结论：本研究为下一步人工合成多肽或表达相应肽段筛选银屑病反应性辅助性T细胞表位打下了一定的理论基础。     

A型肉毒毒素多表位串联体的设计、表达、纯化及鉴定

目的:设计、表达两个A型肉毒毒素多表位串联体.方法:从文献报道的A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)的表位及生物信息学方法预测得到的B细胞表位中遴选表位,并加入适当的辅助性元件,设计多表位串联体A、B.对其基因进行优化后,经重叠PCR方法合成串联体A、B的全长基因.分别插入原核表达载体pQE-30,再转化E.coli M15[pREP4]感受态细胞中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定.结果与结论:成功设计并构建了两个多表位串联体A、B,并在E.coli中以包涵体形式获得高效表达.Ni-NTA法纯化后分别获得纯度大于92.2%、99%的重组串联体A、B蛋白,并经透析复性法复性.Western印迹和间接ELISA显示纯化、复性后的重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清有特异性结合反应.     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

人工改造的A型肉毒毒素重链Hc段基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究

目的 人工合成A型肉毒毒素Hc段基因,并在大肠杆菌中进行高效表达.方法 人工合成Hc段基因,选择宿主细胞偏爱的同义密码子替换其原有稀有密码子,使AT含量降至57.3%,然后将其克隆入pQE-60表达载体,在大肠杆菌中进行可溶性表达.结果 可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的11.5%左右,表达产物可被A型肉毒毒素马血清抗毒素识别.结论 成功地表达并鉴定了A型肉毒毒素Hc蛋白,为进一步进行A型肉毒毒素的疫苗或抗体研究奠定了基础.     

A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究

目的：利用基因工程方法原核表达N－His标签的A型肉毒毒素轻链（ BoNT－ALC）蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体pET22b－ALC,转化BL21（DE3）,诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP－25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的BoNT－ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。     

肉毒神经毒素及其相关医学防护问题

肉毒神经毒素(BoNT)是厌氧梭菌产生的蛋白类外毒素，有A-G7个血清型。它是目前自然界所发现的毒素(包括化学毒物)中毒性最强的物质。BoNT可引起严重的人类食物中毒，称为肉毒中毒(hotulism)。以气溶胶形式施放的BoNT，可作为有效的生物毒素战剂，也是生物恐怖分子最有可能使用的生物恐怖病原之一。本文对BoNT的病原与流行病学、结构特征与作用方式、致病与临床症状、检测与医学防护等作一概述。     

重组肉毒毒素B重链结合区片段的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素B重链结合区C端（BoNT/B Hc）保护性抗原片段.方法：采用PCR扩增BoNT/B Hc基因,插入表达载体pET-His,转化E.coli BL21（pLys）细胞获得表达工程菌株,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化.利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT/B Hc的抗原性.结果：表达工程菌BL21/pETHis-BHc于37℃经0.2 mmol/L IPTG诱导6 h后,目的蛋白获得高表达,约占菌体总蛋白的24%.经过Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,rBoNT/B Hc的纯度可达96%以上.Western印迹和间接ELISA均显示其具有良好的抗原性.结论：成功克隆、表达并纯化了BoNT/B Hc片段,并可被抗天然BoNT/B马血清所识别,为建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚单位疫苗奠定了基础.