天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及APC基因去甲基化

目的:研究天花粉蛋白(TCS)抗宫颈癌作用机制。方法:MTT还原法检测TCS对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用,流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞周期及凋亡率的影响,MSP检测TCS作用前后APC基因启动子甲基化状态。结果:TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性;TCS可以将HeLa细胞阻滞于S期;TCS诱导HeLa细胞发生凋亡,有剂量依赖性;80 mg/LTCS处理HeLa细胞48 h后,APC基因启动子出现去甲基化。结论:TCS对HeLa细胞有明显抑制作用,抑制机理与将HeLa细胞阻滞于S期、诱导细胞凋亡及APC基因启动子出现去甲基化有关,TCS有良好的抗宫颈癌临床应用前景。     

TSLC1基因甲基化与宫颈癌HeLa细胞凋亡相关性的研究

目的研究天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中肿瘤抑制基因TSLC1的甲基化的变化情况,并探讨其在宫颈癌的发生发展中的作用及细胞凋亡和抑癌基因甲基化的相关性,寻找新型的去甲基化药物。方法应用MTT法检测对HeLa细胞增殖抑制的影响;流式细胞仪分析天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞诱导凋亡作用;甲基化特异性PCR技术(MSP)检测天花粉蛋白处理前、后宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CpG岛的甲基化的变化情况。结果宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CpG岛是呈高度的甲基化状态,经天花粉蛋白处理后,HeLa细胞生长明显受抑,流式细胞仪分析出有特征性的亚二倍体凋亡峰,TSLC1基因启动子区CpG岛无异常甲基化表现。结论天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中对TSLC1基因有明显的去甲基化作用,可能是新型的甲基化抑制剂,肿瘤细胞凋亡与抑癌基因的甲基化失活之间可能存在某些相关性。并且TSLC1基因甲基化的检测有可能成为宫颈癌的早期诊断和指导临床治疗的又一指标。     

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法，以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR，构建含有DNA甲基化β-aetin的重组质粒，克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测，建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化，60例宫颈癌标本的甲基化率为28．33％（17／60）。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。     

p16甲基化在宫颈癌癌变中的作用研究

p16基因又称多肿瘤抑制基因,是人们发现的第一个直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的基因。DNA甲基化是抑癌基因失活的机制,p16基因甲基化及其在子宫颈癌癌变中的作用机制还不清楚。本文对宫颈癌中p16基因甲基化的相关研究内容进行综述。     

大肠癌组织中p16、Rb及p27基因启动子区甲基化状态检测

目的:探讨大肠癌组织中p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态的改变及意义.方法:应用甲基化特异性聚合酶链反应方法检测56例大肠癌及其相应癌旁正常上皮、42例腺瘤组织中p16、Rb和p27基因启动子区甲基化状态.结果:腺瘤、癌组织中p16和p27基因启动子区甲基化率均较正常组织增加(,=4.680、9.091和4.0...     

5-Aza-CdR体外诱导人肺癌细胞株p16基因去甲基化

目的观察人肺癌细胞株H719p16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导H719细胞株高甲基化失活的pl6基因重新表达的可能性。方法MSP法检测体外培养的人肺癌细胞株p16基因启动子区甲基化状态,并应用不同浓度的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株H719,MSP法检测用药后细胞中p16基因的甲基化状态,并用RT-PCR方法及Western Blot方法检测用药前后细胞中p16基因mRNA和蛋白水平变化。结果p16基因在人肺癌细胞株H719中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,p16基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA及蛋白恢复表达。结论启动子区异常甲基化是人肺癌细胞株p16基因失活的可能原因,5-Aza-CdR能逆转p16基因甲基化状态。     

天花粉蛋白诱导Syk(L)基因去甲基化抑制喉癌Hep-2细胞生长研究

目的 探讨天花粉蛋白通过全长型脾络氨酸激酶[full-length form of spleen tyrosine kinase,Syk（L）]基因去甲基化途径恢复Syk（L）表达对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭迁移的的抑制作用。方法 采用CCK-8法及Transwell实验检测不同浓度天花粉在不同时间点对Hep-2细胞增殖及处理72h后细胞侵袭迁移能力的影响;采用MS-HRM法、Q-RT-PCR及Western blot法检测不同浓度天花粉蛋白对Hep-2细胞Syk（L）基因甲基化水平及其表达的影响。结果 CCK-8结果显示,天花粉蛋白对喉癌Hep-2细胞的增殖有抑制作用,且呈浓度、结果时间依赖性;Transwell结果显示,天花粉蛋白能显著抑制Hep-2细胞的侵袭迁移能力;MS-HRM结果显示,天花粉蛋白可以逆转Hep-2细胞Sky（L）基因的高甲基化状态,恢复Syk（L）mRNA及蛋白的表达。结论 天花粉蛋白通过逆转Syk（L）基因启动子CpG岛的甲基化状态,使喉癌Hep-2细胞中Syk（L）基因表达活化,恢复Syk mRNA及蛋白的表达,最终发挥抑癌基因的作用抑制Hep-2细胞恶性生物学行为,具有开发并成为抗肿瘤药物的潜在价值。     

ISLC1基因甲基化与宫颈癌HeLa细胞凋亡相关性的研究

目的研究天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中肿瘤抑制基因TSLC1的甲基化的变化情况，并探讨其在宫颈癌的发生发展中的作用及细胞凋亡和抑癌基因甲基化的相关性，寻找新型的去甲基化药物。方法应用MTT法检测对HeLa细胞增殖抑制的影响；流式细胞仪分析天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞诱导凋亡作用；甲基化特异性PCR技术（MSP）检测天花粉蛋白处理前后宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CPG岛的甲基化的变化情况。结果宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CPG岛是呈高度的甲基化状态，经天花粉蛋白处理后，HeLa细胞生长明显受抑，流式细胞仪分析出有特征性的亚二倍体凋亡峰，TSLC1基因启动子区CPG岛元异常甲基化表现。结论天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中对TSLC1基因有明显的去甲基化作用，可能是新型的甲基化抑制剂，肿瘤细胞凋亡与抑癌基因的甲基化失活之间可能存在某些相关性。并且TSLC1基因甲基化的检测有可能成为宫颈癌的早期诊断和指导临床治疗的又一指标。     

天花粉蛋白诱导人宫颈癌HeLa细胞调亡的分子机制研究

目的：利用基因芯片技术研究天花粉蛋白对人宫颈癌Hela细胞基因表达谱的影响,以深入探讨其作用的分子机制.方法：提取药物处理前后HeLa细胞RNA并逆转录成cDNA,在获得的cDNA上分别标记CY3和CY5两种荧光物质,然后与BiostarH-I 表达谱芯片杂交,扫描后对获得的数据用GenePix Pro 3.0软件分析.结果：两组间存在差异性表达基因78条,其中与细胞黏附及细胞间相互作用相关的MGST3、LGALS3BP等16条基因表达下降,与细胞凋亡密切相关的NOP56、TNFSF10、CASP9、DFFB等62条基因表达上调.结论：基因芯片技术能高通量分析天花粉蛋白作用于HeLa细胞的相关靶基因,为进一步揭示天花粉蛋白的抗癌机制提供了新的思路.     

p27基因及其蛋白在大肠癌的表达及其意义

目的　研究 p2 7mRNA和p2 7蛋白在大肠癌的表达及其临床意义。方法　应用原位杂交方法检测 58例大肠癌标本及 58例正常黏膜中p2 7mRNA的表达 ,应用免疫组织化学S P法检测相同组织中 p2 7蛋白的表达。 结果　p2 7mRNA在大肠癌及正常黏膜中的表达阳性率均为 1 0 0 %。p2 7蛋白在大肠癌中的表达阳性率为 55 1 7% (32 / 58) ,在正常组织中的表达阳性率为 96 55 % (56/ 58) ,差异有显著性(P <0 0 1 )。p2 7蛋白表达与肿瘤组织分化程度负相关 ,与其它临床病理因素无关。结论　p2 7蛋白表达的调控主要在转录后水平。p2 7蛋白表达在大肠癌发生过程中具有重要作用 ,其检测有助于大肠癌恶性程度评价和预后判断     

抑癌基因p27对肾癌细胞系GRC-1生长的抑制作用

目的：探讨p27基因对肾癌GRC－1细胞系生长的抑制作用,为肾癌发生机制的研究和基因治疗提供理论依据。方法 采用基因转染技术,将p27 cDNA转染到肾癌GRC－1细胞系中,了解其对细胞增殖能力及细胞周期的影响。结果 转染p27基因的肾癌细胞生长受到抑制,其在软琼脂上克隆形成能力降低了大约4倍。对细胞周期分析表明,处在G0－G1期的细胞由32．2％增加到66．9％,经Dot blot和Western blot杂交证实,p27 mRNA表达有明显差异（P＜0．01）,p27的蛋白表达量有明显差异（P＜0．01）,说明p27蛋白具有生长抑制功能,其作用点为G1－S。结论 提高肾癌细胞中p27的表达,能抑制肿瘤细胞的生长,导入p27基因是一种治疗肾癌的新途径。     

腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:研究携带突变型p27的重组腺病毒(Ad-p27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用,并探讨其抑癌机制。方法:⑴将Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721,Western blotting检测P27、Bcl-2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Ad-p27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Ad-p27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-p27mt转染肝癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,G0/G1期细胞比例增加,P27表达增强,Bax/Bcl-2比例增高,采用Ad-p27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制,肿瘤生长抑制率达57.09%。结论:Ad-p27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用,其机制是通过增强P27表达,使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl-2比例所引起。     

P27和cyclinE在宫颈癌中的表达及其临床意义

目的研究p27蛋白和cyclinE蛋白在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化方法检测60例宫颈癌组织标本中p27及cyclinE蛋白的表达情况,应用χ2检验方法,分析p27和cyclinE蛋白的表达与临床病理因素之间的关系以及两者表达之间的关系。结果p27的表达率为26.7%,在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级宫颈癌中表达率逐渐降低,有极显著性差异(P<0.01)。有淋巴结转移的宫颈癌中表达率低于无淋巴结转移的宫颈癌,有显著性差异(P<0.05)。cyclinE的表达率为71.7%,在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级宫颈癌中表达率逐渐增高,有极显著性差异(P<0.01)。p27与cyclinE的表达之间无明显关系(P>0.05)。结论p27在宫颈癌中的表达与病理分级有极显著关系,与有无淋巴结转移有显著关系。cyclinE在宫颈癌中的表达与病理分级有极显著关系。p27和cyclinE可联合作为评价宫颈癌恶性程度和预后的指标。     

细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组法,构建含人突变p27(hp27mt)基因重组腺病毒. 方法:hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组. 重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定. 结果:用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒. PCR检测表明重组腺病毒含有目的基因. 滴度为7.95×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备均一的高滴度重组腺病毒. 为研究p27mt对消化道肿瘤的治疗奠定了基础.     

巢式甲基化特异性PCR检测p16基因的研究

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性.方法应用巢式甲基化特异性PCR技术(Nested-MSP)及甲基化特异性PCR(MSP),检测了结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因的异常甲基化情况;比较MSP及Nested-MSP两方法的灵敏度.结果应用MSP方法,Dukes A、B期病人和Dukes C、D期病人p16启动子区甲基化率分别为23.8%和59.4%;应用巢式-MSP方法,甲基化率上升至52.4%和84.4%.结论巢式-MSP的灵敏度明显高于普通的MSP技术,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助结直肠癌诊断的有效方法之一.     

外源性p27kip1基因表达对人肝癌细胞生长抑制作用

目的: 研究p27kip1基因对人肝癌细胞的生长抑制作用. 方法: 采用可诱导性真核表达载体pMD-kip1,脂质体转染法将p27kip1全长cDNA转入肝癌细胞系HCC-9204中,通过外加Zn离子诱导目的基因的表达. 免疫印迹分析及RT-PCR检测p27kip1基因在蛋白质和mRNA水平上的表达;细胞活力实验检测转染p27kip1基因对细胞增殖的作用;并将转染的肝癌细胞接种于裸鼠皮下,观察该肿瘤细胞的致瘤情况. 结果: 转染p27kip1的HCC-9204细胞在mRNA和蛋白质水平均显p27kip1高表达. 细胞活力检测显示在外加Zn离子48 h后,细胞生长被抑制35%;转染p27kip1的HCC-9204细胞在裸鼠体内的致瘤能力明显下降[(0.62±0.12) vs (1.31±0.17), P<0.01 )]. 结论: 外源性p27kip1基因表达能够抑制人肝癌细胞的恶性增殖和致瘤性.     

外源性P27kip1基因转染诱导前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的　探索前列腺癌基因治疗的新途径。方法　用脂质体介导 p2 7kip1基因转染前列腺癌 PC- 3 M细胞 ,SABC免疫组化法检测癌细胞外源性 p2 7kip1基因表达 ;MTT比色分析检测癌细胞体外生长活性 ;流式细胞仪 ( FCM)分析细胞周期改变 ;DNA L adder、吖啶橙 -溴化乙啶荧光染色法检测细胞凋亡。结果　发现外源性 p2 7kip1基因转移后 ,前列腺癌细胞 p2 7kip1蛋白水平显著增强 ( P<0 .0 1) ,体外生长抑制 12 .2 4%～ 3 6.5 2 % ( P<0 .0 1) ,出现 G0 / G1 期细胞周期阻滞及凋亡性“亚 G1期”峰 ,电泳可见典型的“梯状”条带 ,凋亡比率为 18.5 % ( P<0 .0 1)。结论　转染外源性p2 7kip1基因能增强对细胞周期的负性调节 ,显著诱导前列腺癌细胞凋亡 ,是前列腺癌基因治疗的潜在途径     

原发性肝癌患者血清p16基因启动子甲基化的分析

目的：分析原发性肝癌(PLC)患者血清中p16启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义。方法：运用甲基化特异性PCR技术，检测64例PLC患者血清p16基因启动子区域甲基化的改变情况，并分析与临床病理资料的关系。结果：PLC患者血清p16基因甲基化检出率为76．6％(49／64)，而正常对照组和良性肝病组患者血清未检出p16基因甲基化，p16基因甲基化检出率与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、疾病分期及转移状态无明显关系。结论：p16基因检出启动子区域异常甲基化是PLC早期辅助诊断的分子标记物之一。     

肺癌病人痰细胞中p16基因高甲基化分析

目的　分析肺癌病人痰标本中p16基因启动子区域异常高甲基化的改变情况 ,评价该指标作为肺癌辅助诊断分子标记物的价值。方法　运用半巢式甲基化特异性PCR技术 ,检测 94例原发性肺癌病人痰标本和部分对应肿瘤组织 ,以及 10例慢性炎病例痰标本中p16基因启动子区域的甲基化改变。结果　 74%的肺癌病人痰标本中检测到了p16基因异常高甲基化 ,与传统细胞学相比 ( 4 6.8%) ,痰标本中p16基因异常高甲基化对肿瘤的检出率灵敏度更高 (P <0 .0 1) ;痰细胞中p16甲基化检测和细胞学相结合 ,对肿瘤的检出率可达 86.17%( 81 94)。如果痰标本中p16基因启动子区域发生高甲基化 ,其对应的肿瘤组织中p16基因亦为高甲基化。 10例慢性炎病人痰标本中仅 3例检测出p16基因甲基化。结论　痰标本中p16基因甲基化是临床肺癌辅助诊断的有效分子生物标记物之一。     

p16、p21、p27基因多态性与上皮性卵巢癌易感性关联的研究

目的探讨抑癌基因p16、p21和p27的多态性与上皮性卵巢癌易感性的关联.方法选取2007年3月-2011年4月间120例卵巢癌患者作为考察对象,同时选取120例健康女性人群作为对照组.分别采集外周静脉血5ml,提取基因组DNA,分析每个样本的基因型,并做统计学分析.结果两组的p16基因C540G的C/C、C/G和G/G基因型频率分布无显著性差异(P>0.05);两组的p16基因C580T的C/C、C/G和G/G基因型频率分布无显著性差异(P>0.05);两组p21基因的T/T、T/C和C/C基因型频率分布无显著性差异(P>0.05);两组的p27基因的V/V、V/G和G/G基因型频率分布有显著性差异(P<0.05).结论 p16基因和p21基因型的多态性上皮性卵巢癌的易感性有关;p27基因的V/V纯合型可能会增加卵巢癌的发病风险,值得临床关注.