ImiS的表达、纯化及催化3类β-内酰胺类抗生素水解的动力学研究

目的:研究金属β-内酰胺酶(MBL)ImiS催化β-内酰胺类抗生素水解的动力学特征,为研发MBLs的通用型抑制剂提供实验数据.方法:在大肠埃希菌中表达ImiS,以SP-Sepharose离子交换层析柱纯化,通过MALDI-TOF MS测定其分子量,用UV-VIS测定ImiS催化法罗培南等3类6种β-内酰胺类抗生素水解的酶动力学参数,并考察不同pH、温度及底物浓度对酶活性的影响.结果:表征获得ImiS的分子量为25209Da,ImiS对法罗培南、青霉素G、氨苄西林及羧苄青霉素水解的催化常数K(cat)分别为(2.15±0.03),(0.85±0.03),(0.71±0.02)和(0.58±0.02)s(-1),对头孢三嗪和头孢噻肟无活性.底物为法罗培南时,ImiS最适活性的pH为7.5±0.1,在酸性环境中酶活性降低较为明显,最适活性的温度为(44.8+0.8)℃.结论:治疗携带ImiS的病菌引起的感染,使用法罗培南不妥,而头孢三嗪或头孢噻肟为合理.实验结果为ImiS抑制剂的设计与合成提供了很有价值的信息.     

法罗培南对质粒介导β-内酰胺酶的稳定性及抑酶作用研究

目的研究青霉烯类抗生素法罗培南对14种标准β-内酰胺酶（TEM-1、TEM-2、TEM-3、TEM-5、SHV-1、SHV-2、SHV-4、SHV-5、PSE-1、PSE-2、PSE-3、OXA-1、OXA-2和OXA-3）的稳定性及抑酶作用。方法采用紫外分光光度法，以其它p内酰胺抗生紊（亚胺培南、美罗培南、头孢噻啶、头孢西丁、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢哌酮、氨曲南、克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦）为对照。结果所有抗生紊对超广谱β-内酰胺酶（TEM-3、TEM-5、SHV-2、SHV-4和SHV-5）的IC50低于1．9μmol／L；但对广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1的IC50超过100μmol／L。法罗培南对OXA-1、OXA-2和OxA-3的IC50低于1．0μmol／L。法罗培南、亚胺培南、美罗培南和头孢西丁对14种标准β-内酰胺酶均稳定。结论法罗培南对14种β-内酰胺酶的抑制作用强于亚胺培南和美罗培南。     

碳青霉烯抗生素对质粒介导β-内酰胺酶的稳定性及抑酶效应研究

用紫外分光光度法，以其它β—内酰胺抗生素为对照，研究碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美洛培南和帕尼培南对14种标准β—内酰胺酶(TEM—1，TEM—2，TEM—3，TEM—5，SHV—1，SHV—2，SHV—4，SHV—5，PSE—1，PSE—2，PSE—3，OXA—1，OXA—2，OXA—3)的稳定性及抑酶作用。亚胺培南、美洛培南、帕尼培南和头孢西丁对14种标准β—内酰胺酶均高度稳定。所有抗生素对超广诺β—内酰胺酶(TEM—3、TEM—5、SHV—2、SHV—4、SHV—5)的IC50低于3μmol/L；但对广谱酶(TEM—1，TEM—2，SHV—1，OXA)的IC50超过100μmol/L。整体上美洛培南对14种β—内酰胺酶的抑制作用强于亚胺培南和帕尼培南。     

美洛培南等抗生素对超广谱β-内酰胺酶的稳定性及抑酶效应研究

用紫外分光光度法,以其它β-内酰胺抗生素为对照,研究美洛培南对6种标准超广谱β-内酰胺酶(TEM-3,TEM-4,TEM-5,SHV-2,SHV-4,SHV-5)的稳定性及抑酶作用.美洛培南、亚胺培南、拉氧头孢和头孢西丁对6种标准超广谱β-内酰胺酶均高度稳定.氨曲南对6种酶的稳定性较好,其相对水解率不超过13%;青霉素及一、二、三代头孢菌素对6种酶均不稳定,大多数相对水解率超过20%.美洛培南和亚胺培南对6种β-内酰胺酶具有良好抑制作用,且抑制程度与抑制剂浓度有关.     

耐亚胺培南铜绿假单胞细菌临床分离株金属酶检测的研究

目的了解昆明地区临床分离的铜绿假单胞菌(PA)亚胺培南耐药株产金属酶β-内酰胺酶的情况。方法以头孢他啶、亚胺培南、美洛培南为底物,乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)为酶抑制剂,应用复合纸片法检测159株临床分离的PA亚胺培南耐药株产金属β-内酰胺酶。结果159株受试菌株中有35株复合纸片试验阳性,表示受试菌株产金属β-内酰胺酶。结论产金属酶是PA对碳青酶烯类抗菌药物耐药的机制之一,实验室重视对金属酶的检测可帮助临床合理选用抗菌药物并减少细菌耐药性的传播。     

青霉素酰化酶促合成β-内酰胺抗生素的过程优化研究进展

β-内酰胺抗生素是临床引用中最为广泛的一类抗生素,其生产正经历由化学合成到生物催化的转变.青霉素酰化酶是半合抗工业中最重要的一类酶,近年来广泛应用于β-内酰胺抗生素合成的研究中.相对热力学控制而言,动力学控制合成是更受青睐.酶促合成过程中的反应条件的优化控制尤为重要,包括pH、温度、底物浓度和底物比等影响因素的选择对于不同来源的酶和不同目的抗生素不尽相同.反应条件优化以及反应器的合理设计可以提高产物的收率并有效降低成本,是合成β-内酰胺抗生素新的研究热点.本文针对各反应因素以及反应器设计进行综述,并指出未来的可能研究方向.     

来源于肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯耐药菌株的新的可水解碳青霉烯的β-内酰胺酶KPC-1

肺炎克雷伯氏菌 15 34由美国北卡罗莱纳州一家医院分离获得 ,表现出中至高度亚胺培南和美罗培南耐药性 (MIC都为 16 mg/ L ) ,当存在克拉维酸时 ,对亚胺培南和美罗培南的β-内酰胺酶活性被抑制 ;对超广谱头孢菌素类抗生素和氨曲南也耐药。等电聚焦研究显示 ,该菌株具有 3种β-内酰胺酶 ,等电点分别为7.2 (SHV- 2 9)、6 .7(KPC- 1)和 5 .4 (TEM- 1)。通过特异性多聚酶链反应和 DNA序列分析证实存在 bla SHV和 bla TEM基因。用大肠埃希氏菌进行的转化和结合研究显示 ,等点电为 6 .7的肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶 - 1(K.p neumoniae ca…     

双纸片增效试验筛查金属β-内酰胺酶

目的：建立简便的双纸片增效试验,筛查产金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌.方法：3组不同底物的双纸片增效试验检测金属β-内酰胺酶,比较其结果.结果：75株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌分别应用亚胺培南、头孢他啶、氨曲南和其EDTA复合纸片检出金属β-内酰胺酶阳性株分别为13,11,10株,阳性率分别为17.3%,14.7%和13.3%;联合应用3组底物,检出阳性株18株,阳性率为24.0%.结论：双纸片增效试验可作为金属β-内酰胺酶的初筛试验.     

院内感染嗜麦芽寡养单胞菌耐药性分析

目的 测定26株临床分离院内感染嗜麦芽寡养单胞菌对常用抗菌药物的耐药性，探索产β-内酰胺酶菌株对亚胺培南的耐药机制。方法 采用琼脂二倍稀释法测定19种抗菌药物对26株临床分离的院内感染嗜麦芽寡养单胞菌的体外抗菌活性，并比较产酶株与非产酶株对抗菌药物的敏感性；测定产酶株所产肛内酰胺酶对亚胺培南的稳定性和丝氨酸β-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶抑制剂的抑酶保护效应。结果 新型氟喹诺酮类药物司帕沙星、左氧氟沙星、加替沙星和多西环素对26株嗜麦芽寡养单胞菌有较强抗菌活性。抑菌率分别为96．2％、96．2％、92．3％、84．6％，SMZ／TMP和替卡西林／克拉维酸抑菌率分别为65．4％和50％，亚胺培南、头孢他啶、头孢哌酮和氨曲南的敏感性较差，耐药率在80％以上；产酶株与非产酶株药敏结果比较，产酶株对含酶抑制剂β-内酰胺类抗生素的敏感性较非产酶株高，而对其它抗菌药物的敏感性变化不大。酶稳定性试验显示，有4株产酶菌产碳青霉烯水解酶，酶抑制试验表明，克拉维酸对这4株菌所产酶无抑酶保护效应，而金属β-内酰胺酶抑制剂EDTA对4株菌所产酶有抑制作用，且酶活性能被ZnCl2复活。结论 新型氟喹诺酮类药物对嗜麦芽寡养单胞菌院内感染株有较强的抗菌活性；4株产酶菌所产碳青霉烯水解酶可能为金属β-内酰胺酶。     

美洛培南等抗生素对超广谱β—内酰胺酶的稳定性及抑酶效？…

用紫外分光光度法,以其它β－内酰胺抗素生素对对照,研究美洛培南对６种标准超广谱β－内酰胺酶的稳定性及抑酶作用。美洛培南、亚胺培南、拉氧头孢和头孢西丁对６种标准超广谱β－内酰胺酶均高度稳定。氨曲南对６种酶的稳定性较好,其相对水解率不超过１３％;青霉素及一、二、三代头孢菌对６种酸疼 均不稳定,大多数相对水解率超过２０％。     

下呼吸道标本铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性及机制探讨

目的探讨下呼吸道标本铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性及机制探讨。方法选择下呼吸道标本中培养分离的铜绿假单胞菌75株,从金属β-内酰胺酶,超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头胞菌素酶（AmpC酶）的产生状况方面来检测其耐药机制。结果 41株对亚胺培南耐药,34株对亚胺培南敏感。耐亚胺培南铜绿假单胞菌中检出产金属β-内酰胺酯酶6株（14.6%）;检出产ESBLs10株（24.4%）,产AmpC酶6株（14.6%）,其中同时产AmpC酶和ESBLs共3株（7.3%）。结论产生金属β-内酰胺酶、ESBLs和AmpC酶是下呼吸道感染患者铜绿假单胞菌对亚胺培能抗生素耐药的主要原因。     

IMP型金属β-内酰胺酶活性中心的计算机模拟分析

应用信息论方法和计算机模拟的方法,对IMP型β-内酰胺酶序列及活性中心进行分析,结果表明在配体结合部位的大部分残基是高度保守的,但也有部分残基易发生变异,如32位Pro、31位Val和163位Try,这些变异是引起该酶不同变异型对β-内酰胺类抗生素水解能力不同的重要原因,在设计抑制剂时需考虑在酶高变区附近分子的柔性,以防出现新突变型而对昕设计抑制剂产生抗性.将酶和底物亚胺培南及青霉素G对接结果表明.底物与酶的结合自由能与酶的催化活性间有很好的相关性,可作为评估底物或酶抑制剂结合能力的重要评价指标.对接模型更细致地显示了酶中与底物相互作用的氨基酸残基,为酶抑制剂的合理设计奠定了基础.     

β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺研究

目的:研究用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺。方法:采用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,以转化率为指标,通过单因素试验考察温度、pH值、酶与底物质量比、底物浓度和反应时间对转化率的影响。结果:酶解反应的优化条件为温度50℃、pH=5.0的枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液、酶与底物质量比1:2、底物浓度1mg·mL-1、反应时间90min。结论:β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,转化率高,工艺简单、可靠,反应条件温和。     

固定化β-葡萄糖苷酶制备人参皂苷F_1的研究

本文探讨了β-葡萄糖苷酶的固定化方法,及利用固定化β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rg1为人参皂苷F1的转化工艺。确定交联-包埋法为最佳固定化方法,应用正交实验得出最佳制备条件为:交联时间3h,戊二醛浓度0.1%,海藻酸钠浓度1%,CaCl2浓度2%。固定化酶与游离酶在热稳定性和pH值稳定性方面显示出不同的性质,其中固定化β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH值为5.5。固定化β-葡萄糖苷酶在15℃环境中保存30d后,酶活回收率为68.82%。固定化β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rg1为人参皂苷F1的转化条件为:固定化酶承载量为3.76U/g固定化酶载体,底物浓度为0.2mg/mL,转化温度为40℃,转化周期为2d,转化次数为4次,平均转化率为80.49%。     

日本三共公司是怎样成功地开发碳青霉烯类Panipenem的

碳青霉烯(carbopenem)类抗生素是一种非典型β-内酰胺类,由于β-内酰胺骨架上以碳代替1位的硫,而且2,3位以双键结合,具有这种结构的β-内酰胺类与典型的β-内酰胺类不同,因此在抗菌活性、抗菌谱和耐β-内酰胺酶等方面都有其独特优点,成为有发展前途的一种新型β-内酰胺类抗生素.硫霉素是较早开发成功的碳青霉烯,继硫霉素之后,美国默克公司又研究成功了亚胺培南.1993年亚胺培南与西司他丁复合剂的销售额已经达到267亿日元,成为世界第三号注射用抗生素.日本三共公司是世界上继默克公司之后研究碳青霉烯类获得成功的公司,它研究成功的panipenem已经上市,而且在许多方面超过了亚胺培南.三共公司是怎样研究成功panipenem的呢?总结他们的经验对我们研究开发新药很有启发.     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株金属酶检测的研究

目的了解云南省安宁地区临床分离的铜绿假单胞菌(PA)亚胺培南耐药株产金属酶β-内酰胺酶的情况。方法以头胞他啶、亚胺培南,美洛培南为底物,以地酸二钠(EDTA-Na2)为酶抑制剂,应用复合纸片法检测159株临床分离的PA亚胺培南耐药株β-金属内酰胺酶。结果 159株受试菌株中有35株复合纸片试验阳性,表示受试菌株产金属β-内酰胺酶。结论产金属酶是PA对碳青酶烯类抗菌药物耐药的机制之一;实验室重视对金属酶的检测可帮助临床合理选用抗菌药物并减少细菌耐药性的传播。     

用固定化德阿昆合假单孢（Pseudomonas dacunhae CPU 210001）生产L—丙氨酸

用卡拉胶固定含有L-天门冬氨酸-β脱羧酶活性的德阿昆合假单孢（P.dacunhae)。该固定化细胞经0.1mol/L天冬氨酸铵，0.1mmol/LPLP和0.2mol/L醋酸缓冲液（pH5.1)的活化液处理24小时，酶尖力可从620IU/g湿细胞提高到13000IU/g湿细胞，最佳酶反应条件研究的结果显示，在pH6.2-7.25范围内和底物浓度为0.4-0.5mmol/L时。固定化细胞表现最高的酶活力。设计了一个能维持反应液pH和底物浓度的循环式反应器，能将天门冬氨酸结晶直接转化成丙氨酸，在144小时的连续转化中，固定化细胞的平均活力为7000IU/g湿细胞。     

铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗菌药物的耐药性分析

目的通过分析铜绿假单胞菌感染患者的临床资料及细菌培养结果等,分析铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗菌药物的耐药性。方法选择160例铜绿假单胞菌感染患者为研究对象,首先对对菌株进行耐药性实验检查。抗菌药卡包括美洛培南（MEM）、亚胺培南（IMI）、头孢他啶（CAZ）、庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AK）、环丙沙星（CIP）、氨曲南（ATM）、左氧氟沙星（LEV）、美洛西林（MEZ）、氯霉素（CMP）、哌拉西彬他唑巴坦（TZP）和头孢哌酮／舒巴坦（SCF）。以亚胺培南（IMI）和头孢他啶（CAZ）为底物,对金属β-内酰胺酶表型进行筛选。结果铜绿假单胞菌对CMP耐药率最高,为93．75％。对MEM耐药率最低,为18．13％。铜绿假单胞菌对美洛培南敏感率为81．88％,显著高于亚胺培南的敏感率61．88％,差异有统计学意义（X2=4．34、4．34,均P〈0．05）。美洛培南敏感铜绿假单胞杆菌MIC值≤1μg／mL菌株比例为76．9％,显著高于亚胺培南,MIC值2～4μg／mL菌株比例为23．1％,显著低于亚胺培南,差异具有统计学意义（X。=5．43、5．43,均P〈0．05）。32株铜绿假单胞杆菌金属β-内酰胺酶阳性率为19．4％。以CAZ为底物阳性11例,以IMI为底物阳性21例。结论铜绿假单胞杆菌对多种抗生素耐药,而对美洛培南敏感性较高,耐药菌株金属β-内酰胺酶表达率高。     

万古霉素与β-内酰胺类联合对MRS的协同抗菌活性

目的比较万古霉素与不同β-内酰胺类、利福平、庆大霉素和红霉素分别联合对34株耐甲氧西林葡萄球菌的协同抗菌活性。方法应用纸片扩散法测定不同抗生素纸片在脑心浸液琼脂板上的抑菌圈；棋盘协同试验应用琼脂稀释法；分数抑菌浓度指数由万古霉素与亚胺培南、苯唑西林和利福平联合获得的分数抑菌浓度的和。万古霉素与其它抗生素的协同作用包括青霉素、苯唑西林、头孢唑林、头孢他啶、亚胺培南、哌拉西林／三唑巴坦、庆大霉素和红霉素应用改良的纸片扩散法。结果万古霉素明显增加β-内酰胺类抗菌药物对6株耐甲氧西林葡萄球菌的抗菌活性，青霉素的抑菌圈直径增加最大，其他依次为苯唑西林、头孢唑林、亚胺培南、哌拉西林／三唑巴坦和头孢他啶，对红霉素和庆大霉素的抑菌圈基本无影响。棋盘法显示万古霉素与亚胺培南、苯唑西林和利福平的联合协同百分比依次为91.2％（31／34）、85.3％（29／34）和35．3％（12／34），对9株万古霉素异质性耐药葡萄球菌的协同百分比依次为100％、100％和33．3％。结论尽管万古霉素与利福平联合有协同作用，但不如万古霉素与β-内酰胺类抗菌药物联合的协同作用强。因此通过改良的纸片扩散协同试验选择与万古霉素最具协同作用的β-内酰胺类抗菌药物。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因的研究

目的:研究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因的存在情况。方法:对60株临床分离的IMPRPa,采用聚合酶链(PCR)方法检测β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因IMP、VIM、OprD2,并对部分IMP、VIM基因的PCR扩增产物进行序列分析。结果:60株受试菌中,β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因检测阳性为:IMP7株,VIM18株,有3株菌同时携带IMP、VIM基因,IMP、VIM基因序列分析为IMP-1型和VIM-2型,OprD2基因缺失29株。结论:OprD2蛋白通道缺失和产金属β-内酰胺酶是IMPRPa耐亚胺培南的主要机制。