Rett综合征患儿一例多种组织的线粒体DNA突变分析

目的：探讨线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征发病中的作用。方法：利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析及ＤＮＡ直接测序等方法，对一例Ｒｅｔｔ综合征患儿的外周血白细胞、死后的脑、骨骼肌组织及其母亲外周血白细胞的线粒体ＤＮＡ的部分片段进行分析。结果：患儿３种组织及其母亲外周血白细胞的线粒体ＤＮＡ上编码１６Ｓ ｒＲＮＡ的２６５０￣３０００区域的ＤＮＡ存在突变，进一步     

Rett综合征患者线粒体DNA突变的初步分析

目的 探讨线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征发病中的作用。方法应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析及ＤＮＡ直接测序结合错配ＰＣＲ的方法，对１５例Ｒｅｔｔ综合征患儿及其中１４例的母亲的外周血白细胞线粒体ＤＮＡ的部分片段进行分析。结果１３例患儿及其中１１例的母亲的线粒体ＤＮＡ上，编码１６ＳｒＲＮＡ基因的２６５０－３０００区域ＤＮＡ突变，其中７例患儿及其中６例的母亲存在２８３５位点的点突变（Ｃ－Ｔ），３０例正常对照均未发现有此点突变。结论线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征的发病中起一定作用。     

良性前列腺增生线粒体DNA控制区突变

目的：研究良性前列腺增生细胞中线粒体DNA控制区的突变情况。方法：取手术切除的22例良性前列腺增生组织和同一患者的淋巴细胞,经提取线粒体DNA、PCR、产物鉴定、重组克隆和DNA测序等过程,得到患者良性前列腺增生细胞和淋巴细胞线粒体DNA控制区序列,观察良性前列腺增生细胞线粒体DNA控制区突变。结果：排除线粒体DNA控制区的多态性改变以后,发现在22例良性前列腺增生患者中18例存在良性前列腺增生细胞线粒体DNA控制区突变,突变位点有27个,多数在第一高变区和第二高变区,突变率为81%（18/22）,突变频率为2.4%（27/1120）,突变类型为转换、颠换和缺失。个体的突变碱基数为0～8个,与患者年龄和增生前列腺重量均无明确关系（P〉0.05）。患者外周血淋巴细胞线粒体DNA控制区的变异与正常前列腺相似,两组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：良性前列腺增生细胞线粒体DNA控制区存在高突变率,这些突变既不随前列腺增大和增龄而积累,也不波及外周血淋巴细胞,其意义有待进一步研究。     

广西汉族早老症家系三例病例研究——线粒体DNA D-环区突变分析

探讨广西汉族1个早老症家系中3例儿童早老症（HGPS）患者线粒体DNA D-环区（D-loop区）突变是否呈现年龄相关的突变累积。方法 采用聚合酶链反应（PCR）对3例HGPS患者及其父母、8例正常老人（正常老人组）的线粒体DNA D-loop区进行扩增、测序。结果 正常老年人线粒体DNA D-loop区较Cambridge序列存在较多的突变位点,HGPS患者与正常老人组线粒体DNA D-loop区突变率差异具有统计学意义（P＜0.05);3例HGPS患者线粒体DNA D-loop区单体型与其母亲一致;未检测到3例HGPS患者线粒体DNA D-loop区发生新突变,也未检测到3例HGPS患者线粒体DNA D-loop区存在差异。结论 该家系3例HGPS患者在7岁前未发生线粒体DNA D-loop突变累积,且不同年龄患者均未见年龄相关的突变累积,推论线粒体DNA突变不是该家系HGPS患者加速衰老的重要原因。     

遗传性共济失调线粒体DNA11778、8344点突变的研究

目的：探索线粒体DNA点突变与遗传性共济失调的关系。方法;采用聚合酶链反应（PcR）扩增临床确诊为遗传性共济失调的26例患者和35例健康对照组外周血白细胞的线粒体DNA,并对PCR产物进行单链构象多态性（SSCP）分析。结果：所有对象均未检测到点突变。结论：遗传性共济失调的发生、发展可能与该区域点突变无关。     

淋巴瘤组织中线粒体DNA突变的研究

目的 通过检测恶性淋巴瘤组织中线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的突变,以探讨mtDNA突变在恶性淋巴瘤发生中的作用.方法 提取38例恶性淋巴瘤组织及其对应患者外周血白细胞的DNA,经PCR扩增部分mtDNA片段,PCR产物直接测序法测定mtDNA序列.以外周血淋巴细胞测序结果作为对照,确定肿瘤组织mtDNA的突变.结果 18例(47.4%)恶性淋巴瘤组织中发现25个突变,25个突变发生在15个核苷酸位点,其中21个突变位于mtDNA的D-Loop区,4个突变位于mtDNA的编码区,D-Loop发生变异的频率是编码区的4.26倍.13个(13/25,52%)突变位于mtDNA多态性位点.结论 恶性淋巴瘤组织中存在mtDNA的突变,mtDNA突变可能与淋巴瘤的发生、进展有一定关系.     

大鼠不同组织器官线粒体DNA缺失定量分析及其与老化的关系

目的：探讨线粒体DNA缺失的组织器官间差异及其与老化和老年性耳聋的关系。方法：依月龄将大鼠分为青年、中年和老年组；测试ABR阈值后从其不同器官组织和外周血中提取DNA；PCR检测线粒体DNA^4834缺失，定量分析；克隆、测序。结果：①随年龄增加，大鼠的ABR平均阈值明显升高；②所有老年大鼠的耳蜗、蜗核、大脑、心肌（1例除外）、肝脏和肌肉组织中均存在mtDNA^4834缺失，外周血仅少数缺失；③中青年组线粒体DNA^4834缺失的发生率和缺失占总mtDNA的百分比均低于老年组（P＜0．01）；④mtDNA^4834缺失存在明显的器官组织间差异，肝脏组织中缺失占总mtDNA的百分比最高。结论：大鼠多种器官组织中mtDNA^4834缺失随增龄而增加，而且存在器官组织间差异，检测外周血白细胞的mtDNA缺失并不能反映体内各器官组织中mtDNA缺失的发生情况，与听觉有关的耳蜗、蜗核组织中mtDNA缺失与老年聋的发生有关。     

Rett综合征患儿2例MECP2基因大片段缺失突变分析

目的研究Rett综合征患儿2例MECP2基因用常规突变筛查方法未检出异常者是否存在大片段的缺失突变。方法用标准的盐析法从外周血提取基因组DNA,用多重连接依赖的探针扩增法(MLPA)进行突变分析,对存在突变的样本进一步用长片段PCR-DNA直接测序进行验证,同时确定突变在基因组序列中的位置。结果2例典型的Rett综合征患儿发现第四外显子有大片段缺失突变。例1用MLPA方法发现在第四外显子的4d探针位置存在缺失,长片段PCR-DNA直接测序证实在cDNA的第905至1138位之间缺失234个核苷酸,并且插入三个核苷酸(c.905-1138delinsCAC);例2用MLPA方法发现在第四外显子的4d和4a探针位置存在缺失,长片段PCR-DNA直接测序证实在cDNA的第1047至1198位之间缺失152个核苷酸(c.1047-1198del152)。结论对于常规的突变筛查不能检出MECP2有突变的Rett综合征患儿,进一步进行MLPA筛查是必要的。MLPA不仅简便、快速,而且能够发现大片断缺失。     

浙江汉族人群线粒体DNA ND1基因G3316A突变与2型糖尿病

目的：研究与日本人2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）相关的线粒体DNA（mitochondria DNA,mtDNA）ND1基因G3316A突变在浙江汉族T2DM人群中的发生率及其临床意义。方法：采用PCR产物直接测序法对浙江籍汉族人群中无血缘关系的315名T2DM患者及158名正常对照的外周血mtDNA进行检测,并用DNASTAR和Antheprot 5.0软件分析突变位点。结果：在T2DM患者中检测到6例（占1.90%）G3316A突变,对照组中发现3例（占1.90%）突变,突变发生率在两组间差异无显著性（P＆gt;0.05）。携带G3316A位点突变的T2DM组与无该突变的T2DM组之间的临床特点（发病年龄、体重指数和血糖水平等）比较差异亦无显著性。蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲的构成比没有发生改变。结论：线粒体DNA ND1基因G3316A突变可能与浙江汉族人群T2DM的发生无关,仅为人群中的基因多态性。     

线粒体DNA HVR区Ⅰ序列突变与肺鳞癌关系的研究

目的分析肺鳞癌患者外周血白细胞及其癌组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)非编码区(又称D-环)高变区Ⅰ(hypervariable regionⅠ,HVRⅠ)序列的突变情况并探讨其意义.方法应用改良一步法制备13例肺鳞癌患者外周血白细胞及肺鳞癌组织mtDNA,PCR产物直接测序,对比分析HVRⅠ区序列突变情况.结果13例肺鳞癌患者癌组织mtDNA HVRⅠ区中,有8例出现了突变,占61.54%;在25个不同位点上共发现30个突变,其中点突变占56.67%(17/30),插入和缺失突变占43.33%(13/30),并发现1例肺鳞癌病人存在10bp片段的缺失.结论肺鳞癌患者癌组织细胞mtDNA HVRⅠ区突变发生率高,其中点突变占有重要地位,插入和缺失突变也不可忽视.     

胆囊收缩素cDNA探针制备及其在癫痫发病机制研究中的应用

①目的　制备胆囊收缩素（ Ｃ Ｃ Ｋ）ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,并以此探针检测遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达。②方法　将含０．５ｋｂｐ Ｒａｔ Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 的质粒 Ｐ Ｕ Ｃ１３ 扩增、回收和纯化,用随机引物标记法,得到地高辛精（ Ｄｉｇ）标记 Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针。用原位杂交技术,对癫痫发作后大鼠海马和大脑皮层 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达进行研究。③结果　 Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针标记效率为５０ｍ ｇ／ Ｌ;遗传性听源性癫痫易感大鼠癫痫发作后脑内 Ｃ Ｃ Ｋｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达显著增加。④结论　本实验制备的 Ｄｉｇ Ｃ Ｃ Ｋｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针,具有较好的特异性和灵敏度;原位杂交实验证实, Ｃ Ｃ Ｋ 参与了癫痫发作过程。     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

几株结核杆菌DNA的限制性内切酶谱比较

改良了一种从结核杆菌中提取高分子量ＤＮＡ的方法，并将所获得的三株人型结核杆菌（两株地方株、一株标准株），一株牛型结核杆菌的ＤＮＡ用于ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＩ、ＨｉｎｄⅢ四种不同的限制性内切酶的消化，经电泳后产生了它们各自的酶谱。结果显示出，牛型结核杆菌的四种酶谱均显著区别于三株人型结核杆菌，说明它作为独立的型别存在；人型结核杆菌标准的ＰｓｔＩ酶谱与两株人型结核杆菌地方株存在显著差异；而两株人     

中国汉族人线粒体DNA RFLPs的初步研究

实验研究对象为17例中国汉族人的mtDNA。通过限制性分析发现3种限制酶(HincⅡ、BamHI和PvuⅡ)酶解片段有RFLP现象,在估计mtDNA之间遗传相似性时,所得到的核苷酸歧异频率的平均值为0.0064。这个值与Brown的0.0036、Cann的0.004和Hotrai的0.00417的值接近,而与Aquado对7个人mtDNA D-环区900个碱基对分析得到的0.02相差较大。在研究突变机制时,发现有6例由于核苷酸的替换引起了限制性位点的增减。文中对其中因点突变引起限制性位点增加的3例进行了讨论。     

光疗前后新生儿的DNA指纹分析

目的：了解光疗对新生儿的ＤＮＡ是否有损伤。方法：采用ＬＥ１１．８小卫星探针，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法检测接受光疗前后新生儿外周血的ＤＮＡ指纹谱带。结果：２２例接受光疗前后的新生儿ＤＮＡ指纹相比，均未见到任何谱带的改变。结论：光疗未引起新生儿的ＤＮＡ损伤，应用国产蓝光治疗器对高胆红素血症新生儿在４８ｈ内治疗是安全的。     

聚合酶链反应检测HBV─DNA及临床意义的再认识

采用聚合酶链反应检测１１４例肝病患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果：１１４例患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率３５．９６％，其中ＡＨ、ＣＰＨ、ＣＡＮ、ＬＣ组ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率分别为４１．６７％、２１．４３％、５３．６６％和２６．３１％；ＨＢｅＡｇ（＋）组３９．０２％，抗ＨＢｃ（＋）组２２．７３％，ＨＢｓＡｇ（＋）、抗ＨＢｃ（＋）组４３．３７％，抗ＨＢｓ（＋）组４１．１８％；ＨＢＶＭ（－）组１１．１１％。结果提示：①ＣＡＨ组阳性率较高（５３．６６％）；②抗ＨＢｅ（＋）患者血清中有高滴度ＨＢＶ－ＤＮＡ，提示仍有传染性；③抗ＨＢｅ（＋）、抗ＨＢｓ（＋）、ＨＢＶＭ（－）的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性可能为ＨＢＶ的变异株感染。     

大肠组织良、恶性肿瘤细胞核DNA含量的定量性研究

采用CMIAS真彩色病理图象分析系统，对62例大肠良、恶性肿瘤细胞核DNA含量进行定量研究。结果显示：非肿瘤性息肉核DNA含量接近正常粘膜，腺瘤、腺癌DNA含量明显高于正常粘膜，统计学处理P＜0．05。腺癌各组织学类型中，分化程度高低的不同，其细胞核DNA含量亦不同，组间有显著差异性（P＜0．05）。研究提示：大肠肿瘤组织细胞核DNA含量的测定有助于进一步了解大肠肿瘤组织的增殖活性和分化程度。     

DNA图像分析在子宫内膜癌诊断中的应用

目的 探讨ＤＮＡ图像分析在子宫内膜癌诊断中的应用价值。方法 对１０例增生期子宫内膜及３２例子宫内膜一测定及图象分析。结果 增生期子宫内膜组细胞ＤＮＡ含量，倍体值、ＤＮＡ指数及核面积与子宫内膜癌组细胞ＤＮＳ含量、倍体值、ＤＮＡ指数以及核面积相比，Ｐ〈０．０１，有显著性差异。３２例子人膜癌均有超５倍体细胞出现，而增生期子宫内膜组无超５倍体细胞出现。结论ＤＮＡ图像分析客观反映肿瘤生物学特点；子宫内膜癌变     

喉鳞状细胞癌DNA含量的FCM定量分析

选择２４ 例未经治疗的喉鳞状细胞癌患者术后新鲜肿瘤标本，通过流式细胞仪（ＦＣＭ）测定ＤＮＡ 含量的３ 个主要参数，异倍体（ａｎｅｕｐｌｏｉｄ）、ＤＮＡ 指数（ＤＮＡ Ｉｎｄｅｘ，ＤＩ）和Ｓ期细胞比例（Ｓ－ｐｈａｓｅ ｆｒａｃ－ｔｉｏｎ，ＳＰＦ），探索３ 个参数与肿瘤组织学分级、临床分期以及淋巴结转移之间的关系。结果表明，２４ 例喉鳞状细胞癌中，异倍体检出率为８３．３％ （２０／２４）。ＤＩ与肿瘤组织学分级和淋巴结转移无关，与肿瘤临床分期有关（Ｐ＜ ０．０５）。ＳＰＦ与肿瘤组织学分级无关，与临床分期及淋巴结转移有关（Ｐ＜ ０．０１，Ｐ＜ ０．０５）。提示：（１）ＤＮＡ异倍体是喉鳞状细胞癌的重要特征之一；（２）ＤＩ和ＳＰＦ可作为预测喉鳞状细胞癌生物学特性的重要指标     

基因变构IL-2重组克隆的构建

①目的 构建基因变构IL-2（88ArgIL-2)的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后，获得cDNA文库，并以此为模板，经套式PCR扩增得IL-2的基因编码序列。测序确认正确后，设计含有突变位点的引物，经pCR定点诱变技术获得变构IL-2克隆并进行序列确定。③结果 IL-2基因定点诱变成功，并获得了基因变构IL-2重组克隆。④结论 IL-2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2奠定了基础。