人间充质干细胞横向诱导分化为角膜上皮细胞及角膜缘干细胞的体外研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外向角膜上皮细胞及角膜缘干细胞横向分化的可能性.方法 从成人骨髓中分离培养出具有MSCs特性的细胞,经过5次传代培养纯化后使用以下5种培养基对MSCs进行诱导分化:1组:DMEM/F12、体积分数10?S;2组:DMEM/F12、体积分数10?S、5 μg·L-1 表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF);3组:DMEM/F12、体积分数10?S、10 μg·L-1 EGF;4组:DMEM/F12、体积分数10?S、15 μg·L-1 EGF;5组:DMEM/F12、体积分数10?S、体积分数50%条件培养基、10 μg·L-1 EGF.其中第1组为对照组,使用的培养基为培养MSCs的培养基.各组细胞培养30 d后,取出细胞爬片进行AE1、AE5和P63的免疫组化染色.结果 从成人骨髓中分离培养出的细胞绝大部分具有MSCs的特性.各诱导分化组的细胞经过AE1染色后计算的细胞诱导转化率分别为:0、(5.28±0.90)%、(15.65±1.65)%、(27.35±2.36)%、(15.53±1.61)%,第2、3、4组着色细胞的数量和着色深度递增,第5诱导分化组的染色情况和第3组相近,对照组染色为阴性.各组AE5染色均为均匀淡染.各组P63染色均为阴性.结论 5～15 μg·L-1 EGF能诱导MSCs横向分化为角膜上皮细胞,而且在此浓度范围内EGF的诱导作用随浓度升高逐渐增强.用成人角膜缘干细胞的培养液制成的体积分数50%条件培养基对诱导MSCs横向分化为角膜上皮细胞无明显促进作用,本实验方法不能将MSCs诱导分化为角膜缘干细胞.     

TGF-β1诱导体外培养角膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对体外培养的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的诱导表达作用。方法体外培养的角膜成纤维细胞分实验组和对照组,对照组弃原培养液,加无血清培养液继续培养,实验组用不同浓度的TGFβ1(0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1)处理24h,用RTPCR方法检测角膜成纤维细胞CTGFmRNA的表达情况。结果1μg·L-1和10μg·L-1TGFβ1处理组CTGF/GAPDH像素比值分别为0.35±0.05和1.25±0.10,均较对照组高(0.13±0.02),差异具有统计学意义,同时CTGF/GAPDH比值随TGFβ1浓度增加而增加。结论TGFβ1可以诱导角膜成纤维细胞CTGF的表达,在角膜成纤维细胞中CTGF也可能是TGFβ1对细胞起作用的下游信号分子。     

转化生长因子β1对牛角膜内皮细胞外基质合成的影响

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对体外培养的牛角膜内皮细胞细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成的影响。方法将体外培养的牛角膜内皮细胞分为实验组和对照组,经0μg·L-1(对照)、0.1μg·L-1、1.0μg·L-1、10.0μg·L-1、100.0μg·L-1浓度的TGF-β1处理48h后,用SABC免疫组化法分别检测角膜内皮细胞纤维连接蛋白和层粘连蛋白的合成情况。结果与对照组相比,一定浓度(1.0μg·L-1及10.0μg·L-1)的TGF-β1能明显促进体外培养的角膜内皮细胞纤维连接蛋白及层粘连蛋白的合成,且呈剂量依赖性。但浓度为0.1μg·L-1及100.0μg·L-1的TGF-β1组OD值与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论一定浓度(1·0μg·L-1及10.0μg·L-1)TGF-β1能促进牛角膜内皮细胞ECM的合成,提示TGF-β1可能在角膜内皮细胞损伤修复中扮演重要角色。     

表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞增生及移行的影响

目的　观察表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)及血清对体外培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞增生及移行的影响。 方法　对培养的人 3～ 6代RPE细胞采用MTT比色法观察不同浓度的EGF(0 .1、1、10、5 0、10 0 μg·L-1)及血清对人RPE细胞增生的影响 ;应用RPE细胞损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察EGF及血清对RPE细胞移行的影响。结果　在细胞增生的实验中 :无血清组 ,10～ 10 0 μg·L-1EGF达到最佳刺激浓度 ,其增生率为 81.8% ;5 0mL·L-1血清组 ,1～10 μg·L-1EGF的刺激作用最强达到 12 2 .7% ;无血清组与 5 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,且 5 0mL·L-1血清可明显促进人RPE细胞的增生 (P <0 .0 0 1)。在细胞的移行实验中 :无血清组 ,1～ 10 0 μg·L-1EGF可促进RPE细胞移行 ,但作用较弱 ;10 0mL·L-1血清组中 1～ 10 μg·L-1EGF促移行作用最强达 4 38.9% ;1～ 10 0 μg·L-1EGF的促进基础RPE细胞移行能力 (最强为 36 % )低于 10 0mL·L-1血清诱导的RPE细胞的移行能力 (强度为 14 7% ) ;无血清组与 10 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　EGF对体外培养的人RPE细胞具有浓度依赖性促增生和移行的作用 ;血清自身也具有此作用     

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5~9代细胞,以不同浓度TGF-β1(0μg·L-1,2μg·L-1,5μg·L-1,10μg·L-1,20μg·L-1)、不同时间(24h、48h、72h)诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF,在0~10μg·L-1内,TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达,至20μg·L-1时表达迅速下降;10μg·L-1TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比,差异有显著性(P<0.01,n=6)。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞,在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。     

表皮生长因子对人角膜内皮细胞损伤修复的影响

目的　观察人表皮生长因子 (epidermal growth factor,EGF)对人角膜内皮细胞损伤修复的影响 ,检测人角膜内皮细胞表皮生长因子受体 (epidermal growth factor recep-tor,EGFR)的表达。方法　胎儿角膜内皮细胞体外培养传一代融合后 ,定量损伤细胞 ,倒置显微镜下观察不同浓度 EGF对角膜内皮细胞损伤修复的影响 ,并于损伤前及损伤后 1、3、7、14 d用间接免疫荧光的方法检测角膜内皮细胞 EGFR的表达。结果　 EGF促进人角膜内皮细胞损伤愈合 ,并显示剂量依赖性 ,EGF在 10 μg· L- 1时促进作用达高峰 ,浓度再增高促进作用下降。人角膜内皮细胞损伤前及损伤后均在细胞膜上表达 EGFR,表现为细胞膜上绿色荧光 ,在未损伤区的细胞及缺损区修复的细胞均见表达。结论　 EGF促进人角膜内皮细胞损伤修复 ,人角膜内皮细胞表达 EGFR     

大鼠视网膜前体细胞的传代培养及体外分化诱导

目的了解表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及睫状神经营养因子（CNTF）对其分化的影响。方法取孕18d的SD大鼠胚胎眼的视网膜，分别用悬浮法及贴壁法培养。传至第一代后转入分别含10ng／mlCNTF、20ng／mlEGF、10ng／mlbFGF、10％胎牛血清的DMEM：F12中进行诱导分化，贴壁后2、3、4、6d分别行nestin、Vimentin、Opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色。结果大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长。nestin及Vimentin染色阳性，悬浮培养传至一代，贴壁培养传至五代，传代后细胞数量不断减少并可在体外分化为含视网膜光感受器细胞及胶质细胞的混合神经元。CNTF、bFGF及EGF不同程度地增加了光感受器细胞的比例。结论RPCs可在体外培养并传代。CNTF、bFGF及EGF参与视网膜发育的调节。     

人角膜上皮干细胞的低钙培养及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的 探讨如何获取较纯的人角膜上皮干细胞,以及碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,bFGF)对人角膜缘上皮干细胞增殖的影响,为干细胞的移植奠定基础。方法 采用低钙培养法对人角膜缘体外培养,将培养的细胞行AE5免疫荧光染色,观察培养细胞的分化状态,并将其分别置于不同浓度的bFGF中,通过数码照相技术和计算机图像分析系统,检测角膜干细胞的增殖。结果 体外培养的细胞以角膜上皮干细胞为主;不同浓度的bFGF(1-100ng/ml)可促进体外培养的人角膜缘上皮干细胞的增殖（P＜0．001）,而各实验组间比较,差异无显著性（P＞0．05）。结论 将无钙培养液与低钙培养基组合,可获得较纯的、未分化的角膜干细胞;bFGF对人角膜上皮干细胞的增殖具有重要的促进作用。计算机图像分析系统适用定量检测呈膜状生长的上皮细胞增殖,是一种新颖、实用、准确的检测手段。     

体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

目的探索以人永生化角膜上皮细胞( immortalized human corneal epithelial cells,ihCEC) 培养液体外模拟角膜上皮细胞微环境,诱导人羊膜上皮细胞( human corneal epithe-lial cells,hAEC) 分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法取( 37 ± 1) 周剖宫产人羊膜组织,酶消化法提取 hAEC; 流式细胞仪测 CD29、CD90、CD105、CD34、HLA-DR 的表达。复苏培养 ihCEC,以 0 mg·L- 1、10 mg·L- 1、20 mg·L- 1、30 mg·L- 1、40 mg·L- 1丝裂霉素 37℃作用 2 h,吸去丝裂霉素,继续培养 72 h 后 CCK8 测吸光度并计算增殖抑制率。10 mg·L- 1、20 mg·L- 1丝裂霉素处理细胞后 12 h、24 h 收集细胞培养液培养 hAEC,CCK8 测吸光度绘制生长曲线; 收集 ihCEC 细胞培养液,制备条件培养基( CM) 培养 hAEC 10 d,倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光检测 CK12 的表达。结果 hAEC 可表达 CD29、CD90、D105,不表达 CD34、HLA-DR; 各浓度丝裂霉素组增殖抑制率分别为 10 mg·L- 1( 65. 48% ±1. 03) 、20 mg · L- 1( 77. 01% ± 0. 99) 、30 mg · L- 1( 75. 25% ± 0. 71) 、40 mg · L- 1( 76. 90% ±0. 97) ;20 mg·L- 1丝裂霉素培养 12 h 收集的细胞培养液对 hAEC 具有明显促增殖作用; 诱导分化后 hAEC 可表达 CK12。结论以 ihCEC 细胞培养液模拟的角膜上皮细胞微环境可诱导 hAEC 分化为角膜上皮样细胞。     

重组人表皮生长因子对牛品状体上皮细胞增殖的影响

目的 观察重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)对牛晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)增殖的影响.方法 体外培养牛LEC,在培养液中分别加入0 μg·L-1、1 μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1、1000 μg·L-rhEGF,加药后72 h采用MTT法,在酶标仪490 nm波长处测定吸光度值并观测细胞增殖变化.结果 0μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、50μg·L-1、100 μg·L-1、1000μg·L-1的rhEGF作用于LEC 72 h后MTT法测得的OD值分另4为0.166±0.029、0.195±0.017、0.232±0.034、0.263±0.019、0.315±0.009、0.261±0.005、0.206±0.043.结论 rhEGF对牛LEC增殖有明显的促进作用,且呈浓度相关.     

Cells, cells, and more cells

A 64-year-old woman presented with bilateral optic nerve swelling, vitreous cells, and cerebrospinal fluid monocytic pleocytosis. A chest radiograph and computed tomography demonstrated a lesion in the left lung, which histologically was confirmed to be a small-cell lung carcinoma. The serum was positive for the anti-CV2 (anti-CRMP-5) antibody. Following treatment with chemoradiation the optic nerve swelling and vitritis resolved. The differential diagnosis of uveal-meningeal diseases is discussed and the pathophysiology and clinical manifestations of paraneoplastic syndromes reviewed.     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells

Purpose. We investigated whether human limbal niche cells generate mesenchymal stem cells. Methods. Limbal niche cells were isolated from the limbal stroma by collagenase alone or following dispase removal of the limbal epithelium (D/C), and cultured on plastic in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum (FBS), or coated or three-dimensional Matrigel in embryonic stem cell medium with leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor. Expression of cell markers, colony-forming units-fibroblast, tri-lineage differentiation, and ability of supporting limbal epithelial stem/progenitor cells were compared to limbal residual stromal cells. Results. Stromal cells expressing angiogenesis markers were found perivascularly, subjacent to limbal basal epithelial cells, and in D/C and limbal residual stromal cells. When seeded in three-dimensional Matrigel, D/C but not limbal residual stromal cells yielded spheres of angiogenesis progenitors that stabilized vascular networks. Similar to collagenase-isolated cells, D/C cells could be expanded on coated Matrigel for more than 12 passages, yielding spindle cells expressing angiogenesis and mesenchymal stem cells markers, and possessing significantly higher colony-forming units-fibroblast and more efficient tri-lineage differentiation than D/C and limbal residual stromal cells expanded on plastic in DMEM with 10% FBS, of which both lost the pericyte phenotype while limbal residual stromal cells turned into myofibroblasts. Upon reunion with limbal epithelial stem/progenitor cells to form spheres, D/C cells expanded on coated Matrigel maintained higher expression of p63α and lower expression of cytokeratin 12 than those expanded on plastic in DMEM with 10% FBS, while spheres formed with human corneal fibroblasts expressed cytokeratin 12 without p63α. Conclusions. In the limbal stroma, cells subjacent to limbal basal epithelial cells serve as niche cells, and generate progenitors with angiogenesis and mesenchymal stem cells potentials. They might partake in angiogenesis and regeneration during corneal wound healing.     

Amacrine cells,bipolar cells and ganglion cells of the cat retina: A Golgi study

Neuronal types contributing to the inner plexiform layer of the cat retina are described based primarily on light microscopy of Golgi-impregnated retinal whole-mounts. Cells have been characterized on morphological criteria that include dendritic branching patterns, dendritic tree sizes, cell body sizes and stratification of processes in the inner plexiform layer. Nine different types of bipolar cell, 22 different types of amacrine cell and 23 different types of ganglion cell can be distinguished using one or more of these morphological criteria. The significance of the different morphological types of cells is discussed, particularly in relationship to the functional bisublamination of the cat inner plexiform layer.     

兔羊膜成体干细胞培养及体外定向诱导神经细胞分化

目的 观察体外分离、培养的兔羊膜成体干细胞(ADSC)定向诱导神经细胞的分化结果.方法 新西兰雌兔羊膜分离、培养ADSC.实时定量聚合酶链反应(PCR)检测羊膜ADSC的纤连蛋白(Fibronectin)、巢蛋白(Nestin)、波形蛋白(Vimentin) mRNA的表达水平.单克隆形成实验证实羊膜ADSC是否具有自我复制能力.培养成功的ADSC中加入神经分化诱导培养基诱导神经细胞分化.诱导分化5d后,免疫荧光染色检测β-微管蛋白(tubulin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 培养的ADSC在24 h后逐渐从羊膜组织中移行出;72 h可见明显的多角形细胞富集在羊膜组织周边;120 h后多角形细胞致密地分布于羊膜四周.分裂后的子代细胞形态同父代细胞.单克隆形成实验结果证实羊膜ADSC具有自我复制能力.实时定量PCR检测结果显示,羊膜ADSC的Nestin、Vimentin、Fibronectin mRNA分别是脾脏细胞同种分子表达量的15.79、1.91、7.65倍,两者差异有统计学意义(Z=-5.243、-3.972、-2.524,P＜0.05).免疫荧光染色结果显示,β-tubulin在大部分细胞的胞质中表达;GFAP在部分细胞的细胞质中表达.结论 羊膜ADSC具有自我复制能力,在合适条件下能够分化成神经元和神经胶质细胞.     

RDS／peripherin表达载体的构建和在COS—1细胞的表达

目的 构建大鼠ＲＤＳ／ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ真核表达载体ｐＡＬＴＥＲ－ＲＤＳ,并观察在ＣＯＳ－１细胞中的表达,方法 将全长度的ＲＤＳ／ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎｃＤＮＡ（１．５ｋｂ）插入到真核表达载体ｐＡＬＴＥＲ－ＭＡＸ中,构建了ＲＤＳ真核表达载体ｐＡＬＴＥＲ－ＲＤＳ,采用电穿孔技术将其转染ＣＯＳ－１细胞,转染４８ｈ后,采用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＤＳ／ｐｅｒｉｈｐｅｒｉｎｃＤＮＡ的表达,结果 采用ＲＴ－ＰＣＲ