褪黑素对过氧化氢诱导血管内皮细胞损伤的拮抗作用及其机制

目的:研究不同浓度褪黑素（melatonin,MLT）对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活力的影响,以及对过氧化氢(H2O2)诱导血管内皮细胞损伤的拮抗作用及机制。方法: 分别用不同浓度（125、250、500 μmol/L）的MLT处理体外培养的HUVECs 2 h、4 h和6 h后,用噻唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度的MLT对HUVECs存活率的影响。以300 μmol/L的H2O2建立HUVECs损伤模型,用125、250、500 μmol/L的MLT与H2O2（300 μmol/L）共同处理HUVECs 2 h、4 h和6 h后,分别用噻唑蓝（MTT）比色法测细胞的存活率、细胞黏附实验评价细胞黏附能力、酶活性测定法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力。用Griess法测定细胞培养液中NO-2的浓度来反映HUVECs的一氧化氮(NO)释放量。结果: 以不同浓度的MLT处理内皮细胞 2 h、4 h和6 h后,内皮细胞的存活率无统计学差异。MLT能明显提高H2O2损伤的内皮细胞的存活率、黏附能力及细胞内SOD的活力（P<0.01）,增加培养液中NO含量（P<0.01）,降低内皮细胞LDH的释放（P<0.01）。以500 μmol/L的MLT效果最明显。结论: 不同浓度的MLT对HUVECs的存活率均无影响,提示MLT药物浓度的安全范围较大。MLT对H2O2诱导HUVECs损伤的拮抗作用可能与其抗氧化能力和促进内皮细胞合成NO有关。     

三氧化二砷对K562细胞生长及Ki-67和Survivin表达的影响

目的：探讨三氧化二砷(As2O3)对K562细胞生长的影响及K562细胞对As2O3的抵抗机制。方法：以不同浓度As2O3作用于K562细胞后，用四唑盐(MTT)比色法分析细胞的生长增殖，用台盼蓝排斥试验观察细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡以及Ki-67抗原和Survivin的表达。结果：2μmol／L As2O3能明显抑制K562细胞生长，但细胞活力、增殖相关抗原Ki-67的降低和凋亡发生在5μmol／L As2O3作用48h后才较为明显；同时As2O3作用后抗凋亡蛋白Survivin的表达均有不同程度的增加。结论：As2O3能有效抑制K562细胞的生长，但对细胞增殖能力的抑制及凋亡的诱导作用不如前者明显；Survivin的表达增加可能是K562细胞对As2O3诱导凋亡的抵抗机制之一。     

原钒酸钠对成骨细胞株MC 3T3-E1增殖的影响及其与一氧化氮浓度的关系

目的　探讨原钒酸钠对成骨细胞株MC3T3 E1增殖的影响及其是否与一氧化氮 (NO)浓度有关。　方法　以噻唑蓝 (MTT)比色法检测MC3T3 E1细胞增殖及增殖抑制情况 ,用酶还原法测定细胞培养物上清液中NO的浓度。　结果　在低浓度 (2 5～ 10 0 μmol/L)原钒酸钠作用 2 4h后 ,MC3T3 E1细胞MTT测定值 (2 5 μmol/L时为 0 3380± 0 0 0 4 5、5 0 μmol/L时为 0 340 0±0 0 14 1、10 0 μmol/L时为 0 384 0± 0 0 313)较对照组 (0 2 5 4 0± 0 0 16 7)明显增加 (P均 <0 0 0 1) ;高浓度 (≥ 5 0 0 μmol/L)时则明显下降 ,5 0 μmol/L时为 0 2 16 0± 0 0 182 ,10 0 μmol/L时为 0 192 0±0 0 179(P均 <0 0 1) ;且作用 2 4、4 8和 12 0h细胞增殖趋势一致。细胞培养上清液中的NO浓度与MTT测定值成正比。 2 5 μmol/L原钒酸钠时NO浓度为 (17 2 0 8± 0 70 1) μmol/L ,5 0 μmol/L时为(7 386± 1 0 39) μmol/L ,空白对照组为 (15 341± 0 0 4 1) μmol/L。且低浓度原钒酸钠能减弱NO合酶(NOS)抑制剂L 硝基精氨酸甲酯 (L NAME)的细胞增殖抑制作用。　结论　低浓度原钒酸钠能促进MC3T3 E1细胞的增殖 ,高浓度则抑制增殖。NO可能参与调节原钒酸钠对MC3T3 E1增殖的作用。     

三氧化二砷体外对人卵巢上皮癌细胞3AO增殖及凋亡的影响

目的　探讨三氧化二砷 (As2 O3 )体外对人卵巢上皮癌细胞株 3AO增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法　将人卵巢上皮癌细胞株 3AO与不同浓度的As2 O3 进行体外培养 ,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)测定不同浓度As2 O3 对 3AO细胞的生长抑制率 ,采用流式细胞技术检测细胞凋亡率、细胞周期时相及其Fas、FasL、P53 和bcl 2蛋白的表达。结果　 0 2 5～ 8 0 μmol /L浓度的As2 O3 均显著抑制3AO细胞的增殖 ,且随浓度升高及作用时间的延长 ,抑制率上升 ,As2 O3 与 3AO细胞联合培养 4 8小时的半数致死量 (IC50 )为 (3 90± 0 2 0 ) μmol /L。 0 2 5～ 4 0 μmol /L浓度的As2 O3 均诱导 3AO细胞凋亡 ,随浓度升高 ,凋亡率上升。As2 O3 阻滞 3AO细胞停滞于S期 ,并诱导细胞凋亡。As2 O3 (2 μmol/L )培养3AO细胞 4 8小时 ,Fas蛋白表达率为 (4 6 76± 4 5 0 ) % ,明显高于对照组的 (6 36± 0 82 ) % ,差异有显著性(P <0 0 5 ) ,FasL、P53 和bcl 2蛋白表达无明显变化 (P >0 0 5 )。结论　As2 O3 以剂量 时间依赖性方式抑制人卵巢上皮癌细胞 3AO增殖并诱导其凋亡 ,其作用机制与上调Fas基因表达有关。     

三氧化二砷对肝癌细胞增殖的影响

为探讨三氧化二砷 (As2 O3)对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用 ,应用台盼蓝拒染法、MTT比色法及细胞克隆形成试验 ,研究As2 O3 对肝癌细胞的增殖抑制和细胞毒作用。结果发现As2 O3 能显著抑制肝癌细胞的生长 ,5 μmol/LAs2 O3 抑制程度明显强于 1μmol/L。 5 μmol/L和 1μmol/LAs2 O3 作用后细胞克隆形成率分别为 1.5± 1.2 %和 12 3± 2 .2 % ,明显低于对照组的 30 .0± 4.2 % (P <0 .0 1)。As2 O3 对肝癌细胞有较强的细胞毒作用 ,且呈显著剂量和时间依赖性。其对于肝癌细胞的杀伤率高于 5 氟脲嘧啶 ( 5 FU )和丝裂霉素 (MMC) ,但无显著差异。As2 O3 与 5 FU及MMC存在协同效应 ,联合应用 ,对肝癌细胞的杀伤率明显升高。说明As2 O3 具有明显的抑制肝癌细胞增殖的作用 ,有必要进一步探讨其对肝癌的治疗价值     

氟对人牙乳头间充质细胞及分泌碱性磷酸酶活性的影响

为了明确氟对人牙乳头间充质细胞和分泌碱性磷酸酶活性的影响 ,体外培养人牙乳头间充质细胞 ,给予不同浓度氟处理 :0 μmol,10 μmol(0 .2× 10 - 6 g/ L) ,5 2 μmol (1.0× 10 - 6 g/ L) ,2 6 3μmol(5 .0× 10 - 6 g/ L) ,1315 μmol (2 5×10 - 6 g/ L) ,2 6 30 μmol(5 0× 10 - 6 g/ L) ,用四唑盐比色法 (MTT法 )测定细胞活力 ,酶联免疫法检测碱性磷酸酶活性 ,结果显示 ,当氟浓度为 2 6 3μmol时 ,培养 2 4 h后 ,细胞活性明显抑制 ,AL P活性无明显改变 ;当氟浓度为 1315 μmol和2 6 30 μmol时 ,培养 12 h细胞活性明显抑制 ,分泌的 AL P活性升高 ,培养 72 h时 2 6 30 μmol氟浓度组几乎无活细胞 ,而AL P活性仍较对照组高 ,由此提示 ,氟作用于人牙乳头细胞时 ,细胞活性与 AL P活性升高不一致     

三氧化二砷对人骨肉瘤U2-OS细胞增殖和周期的影响

目的观察三氧化二砷（As2O3）在体外对人骨肉瘤U2-OS细胞增殖及周期的影响。方法将对数生长期人骨肉瘤U2-OS细胞分为两组,实验组分别加入0.51、.01、.5μmol/L As2O3,阴性对照组加入同体积培养液,阳性对照组加入5-Fu 15 mg/L,采用MTT比色法检测各组24、48、72 h增殖抑制率,流式细胞仪检测48 h后细胞周期变化。结果各浓度的As2O3对骨肉瘤U2-OS细胞均具有抑制增殖作用,且呈剂量和时间依赖性;随着As2O3浓度的升高,细胞周期发生S期阻滞,与正常对照组相比有统计学差异（P〈0.05）。结论 As2O3能抑制骨肉瘤U2-OS细胞增殖,其机制可能为使细胞发生S期阻滞。     

砷雌激素样效应及对HeLa细胞生长的影响

目的 观察砷雌激素样效应及对HeLa细胞体外生长的影响作用.方法 实验分为8组,RPMI1640培养液分别含雌二醇(E2,1 nmol/L)、三氧化二砷(A82O3,0.5、1.0、5.0 μmol/L)、雌二醇拮抗剂(ICI,500nmol/L)、E2(1 nmoL/L)+ICI(500 nmol/L)、As2O3(1.0μmol/L)+[CI(500 nmol/L)以及对照组,以含有不同处理因素的RPMI 1640培养液培养HeLa细胞24、48、72 h.光镜下观察72 h时HeLa细胞生长状况,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各时间点HeLa细胞存活率,流式细胞计量术检测48 h时HeLa细胞周期.结果 形态学观察E2组和0.5μmol/L As2O3组细胞数量明显多于对照组,长势旺盛.24、48、72 h E2组和0.5μmoL/L As2O3组对HeLa细胞的增殖促进率分别为6.35%、11.56%、38.33%及6.35%、8.50%、20.26%.两组作用效果相似,对细胞生长起到增殖促进作用.与对照组[(41.68±1.05)%]比较,E2组[(55.72±2.31)%]和0.5μmol/L As2O3组[(47.82±1.41)%]S期细胞有增多趋势,其他各组则减少,其中5.0 μmol/L As2O3组[(21.1l±4.99)%]、ICI组[(20.16±4.76)%]明显减少,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 小剂量As2O3具有雌激素样效应,可促进HeLa细胞的生长.     

三氧化二砷对人恶性黑素瘤细胞株A375生长和凋亡影响的研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）对人恶性黑素瘤细胞株A375的生长抑制与促凋亡作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）还原法检测As2O3对黑素瘤细胞的抑制作用；倒置显微镜、电镜观察细胞形态变化和凋亡特征；流式细胞仪分析DNA含量和检测细胞周期。结果1．0、2．0、4．0、8．0、16．0μmol／L As2O3均能抑制A375细胞的生长，且抑制率具有浓度和时间依赖性。8．0和16．0μmol／L组主要表现细胞毒性作用；4．0μmol／L组作用72h后，A375细胞出现较典型的凋亡形态特征，流式细胞仪检测到亚二倍体凋亡峰，同时出现S期阻滞。结论As2O3能有效的抑制人恶性黑素瘤细胞株A375的生长并促进其凋亡。     

丹参素促大鼠心肌细胞及心脏干细胞增殖的作用

目的：大鼠原代心肌细胞及心脏干细胞（CSCs）培养条件的筛选及丹参素（DS-182）对两种细胞体外增殖的影响。方法：对比组织块培养法及差速培养法,选取适宜培养基、消化液浓度、消化时间、差速贴壁时间及心脏成纤维细胞（CFs）抑制剂等因素。分别用MTT比色法、ELISA法及流式细胞术（FCM）检测丹参素对大鼠心肌细胞及CSCs体外增殖的影响。结果：确定DMEM/F12 1∶1培养基、100 ml/L胎牛血清（FBS）、2.5 g/L胰蛋白酶、5 min/次×5次的消化时间及120 min的差速贴壁时间为最适分离纯化条件。MTT比色法检测显示,与空白对照组相比,经浓度为7.8×10-4~1×10-1 mol/L的DS-182处理12、24、48和72 h后,细胞的吸光度（A）值明显增加（P〈0.05）。ELISA法检测显示,与空白对照组相比,经浓度为3.9×10-4~1×10-1 mol/L的DS 182处理24 h后,细胞的A值明显增加（P〈0.05）。FCM检测显示,经浓度为0.1 mol/L的DS-182处理24 h后,c-kit＋的细胞数占细胞总数的比例增加了27.0%。结论：改良了一套较为完整的大鼠心肌细胞及CSCs的分离纯化方法。DS-182在一定浓度下（7.8×10-4~1×10-1 mol/L）对大鼠心肌细胞及CSCs的增殖具有明显的促进作用。     

PPARs激动剂对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 探讨PPARs激动剂吡格列酮对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 首先用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）将体外培养的RAW264.7巨噬细胞诱导分化为泡沫细胞,然后进行油红O染色,并在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化;再以不同浓度吡格列酮（0 μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L）作用泡沫细胞24h,以30 μmol/L的吡格列酮作用0h、6h、12h、24 h、48 h;最后酶法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①50 mg/Lox-LDL诱导巨噬细胞48 h后分化为泡沫细胞.②与对照组相比,不同浓度吡格列酮作用后泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈剂量依赖性.③与对照组相比,30 μmol/L的吡格列酮作用6h、12 h、24 h、48 h后,泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈时间依赖性.结论 PPARs激动剂吡格列酮能够减少泡沫细胞内胆固醇含量,且呈剂量和时间依赖性。     

As2O3联合Aspirin对诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的:观察As2O3与Aspirin联合应用对肝癌细胞Bel-7402的影响,并探讨其作用机制.方法:体外培养肝癌Bel-7402细胞,Aspirin、As2O3不同浓度孵育细胞.倒置显微镜观察细胞形态学改变,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测As2O3和Aspirin单独及联合应用对Bel-7402细胞增殖情况的影响,流式细胞术观察细胞凋亡情况,并通过流式软件分析细胞周期变化.结果:As2O3及Aspirin对肝癌Bel-7402细胞生长均呈不同程度的抑制,且呈浓度依赖性.二者联合具有协同作用,药物联用组抑制率均显著高于单独应用同等剂量As2O3组和Aspirin组(P<0.05).2.0μmol/LAs2O3与0.2mmol/LAspirin联用组与2.0μmol/LAs2O3单药组相比,凋亡率从5.64%±0.56%提高到7.35%±0.62%,差异具有统计学意义(P<0.05).且通过对两组细胞周期检测发现,G1期细胞从40.52%±0.64%下降到32.03%±0.97%,G2期及S期细胞分别从9.57%±0.82%、50.41%±0.32%上升到13.66%±0.82%、54.37%±0.69%,Aspirin能显著增强As2O3诱导细胞集中于S及G2期的作用,从而增强其促凋亡作用.结论:Aspirin能增强As2O3诱导细胞凋亡的作用,该作用可能与影响细胞周期有关.     

不对称二甲基精氨酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 观察不对称二甲基精氨酸（ADMA）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 THP-1单核细胞给予160nmol/L佛波酯（PMA）孵育48h,诱导分化成巨噬细胞,与80mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育24h,使巨噬细胞转化为泡沫细胞,用油红O染色在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化.再以不同浓度ADMA（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L）作用泡沫细胞24h,以20μmol/L ADMA作用泡沫细胞不同时间（0h,6h,12h,24h,48h）,酶比色法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①单核细胞加人PMA诱导48h后,分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导24h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L,30μmol/L的ADMA作用于,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）,③与对照组相比,20μmol/L的ADMA作用于THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞12h,24h,48h,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）.结论 ①单核细胞株THP-1经PMA诱导后,可分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导后,可转化为泡沫细胞.②ADMA可以增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的含量.     

Induction of apoptosis by arsenic trioxide and hydroxy camptothecin in gastriccancer cells in vitro

AIM To study the effects of arsenic trioxide and HCPT on different degrees of differentiated gastric cancer cells (SGC-7901, MKN-45, MKN-28)with respect to both cytotoxicity and induction of apoptosis in vitro. ~ODS The cytotoxicity of As2O3 and HCPT on gastric cancer cells was determined by MTTassay. Morphologic changes of apoptosis of gastric cancer cells were observed by light microscopy and transmission electron microscopy. Apoptosis and cell cycle changes of gastric cancer cells induced by HCPT and As2O3 were investigated by TUNEL method and flow cytometry. RESULTS As2O3 and HCPT had remarkable cytotoxic effects on different degrees of differentiated gastric cancer cells. The IC50 of As2O3 on well differentiated gastric cancer cell MKN-28, moderately differentiated gastric cancer cell SGC-7901, and poorly differentiated gastric cancer cell MKN-28 were 8. 91 μmol/L, 10. 57 μmol/L, and 11.65 μmol/L, respectively. The IC50 of HCPT on MKN-28, SGC-7901, and MKN-45 were 9. 35 rg/L, 10. 21 rg/L, and 12. 63 mg/L respectively after 48 h treatment. After 12 h of exposure to both drugs, gastric cancer cells exhibited morphologic features of apoptosis, including cell shrinkage, nuclear condensation,and formation of apoptotic bodies. A typical subdiploid peak before G0/G1 phase was observed by flow cytometry. The apoptotic rates of SGC7901, MKN-45, and MKN-28 were 13. 84%, 22.52%, and 9. 68%, respectively after 48 h exposure to 10 μmol/L As2O3. The apoptotic rates of SGC-7901, MKN-45, and MKN-28 were 21.88%, 12.35%, and 30. 26%, respectively after 48 h exposure to 10 mg/L HCPT. The apoptotic indice were 7% - 15% as assessed by TUNEL method. The effect of As2O3 on SGC-7901 showed remarkable cell cycle specificity, which induced cell death in G1 phase, and blocked G2/M phase. HCPT also showed a remarkable cell cycle specificity, by inducing cell death and apoptosis in G1 phase and arrest of proliferation at S phase. CONCLUSION AS2O3 and HCPT exhibit significant cytotoxicity on gastric cancer cells by induction of apoptosis. As2O3 and HCPT might have a promising prospect in the treatment of gastric cancer, which needs to be further studied.     

阿托伐他汀对晚期糖基化终末产物诱导的人内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1mRNA表达影响及其机制的实验研究

目的 观察阿托伐他汀对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)诱导的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响,并探讨其作用机制.方法 实验分组:(1)空白对照组.(2)牛血清白蛋白(BSA)对照组.(3)AGE诱导组:不同作用浓度的AGE(10-4、10-3、10-2及10-1g/L)与细胞共同培养24 h.(4) AGE+阿托伐他汀组:用不同作用浓度的阿托伐他汀(0.1、1、10 μmol/L)分别与细胞培养1 h,而后加入10-1 g/L AGE[根据(3)实验结果选取最佳浓度]与细胞共孵育24 h.(5)PPAR-γ激动剂(15 d-PGJ2)组:15 d-PGJ2( 10 μmol/L)与细胞孵育1 h后加入10-1 g/L AGE再与细胞共孵育24 h.(6)PPAR-γ抑制剂(GW9662)组:GW9662(5000 g/L)与细胞孵育1 h后加入AGE(10-1 g/L)和阿托伐他汀(1 μmol/L)[根据(4)实验结果选取最佳浓度]再与细胞共孵育24 h.胶原酶消化法获取人脐静脉内皮细胞.逆转录聚合酶链反应法分析细胞MCP-1和过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPAR-γ)基因的表达.蛋白免疫印迹法测定细胞核因子-κB(NF-κB )p65表达水平.结果 (1)AGE(10-4、10-3、10-2及10-1 g/L)呈浓度依赖性提高人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达水平,分别是空白对照组的1.53倍、2.12倍、2.56倍及4.71倍;AGE浓度为10-4 g/L时,细胞MCP-1 mRNA表达明显高于空白对照组(0.26±0.02比0.17±0.04,P<0.01).(2)与AGE组比,阿托伐他汀(0.1、1、10 μmol/L)呈浓度依赖性抑制AGE诱导的人内皮细胞MCP-1 mRNA的表达;阿托伐他汀浓度为1 μmol/L时,细胞MCP-1 mRNA表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.63±0.11比1.03±0.07,P<0.01).(3)AGE(10-1 g/L)组人脐静脉内皮细胞PPAR-γ mRNA的表达水平显著低于空白对照组(0.22±0.08比0.69±0.09,P<0.01),磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著高于空白对照组(0.78±0.06比0.31±0.01和1.61±0.16 比0.59±0.14,P均<0.01).(4)阿托伐他汀(1、10 μmol/L)组人脐静脉内皮细胞PPAR-γ mRNA表达水平显著高于AGE(10-1 g/L)组(0.59±0.02和0.61±0.06比0.22±0.08,P均<0.01);阿托伐他汀(1 μmol/L)组磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.40±0.03比0.78±0.06和0.65±0.12比1.61±0.16,P均<0.01).(5)PPAR-γ激动剂(15 d-PGJ2)组细胞磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组 (0.21±0.01比0.78±0.06和0.67±0.14比1.61±0.16,P均<0.01),MCP-1 mRNA表达水平显著低于AGE(10-1g/L)组(0.17±0.02比0.93±0.12,P<0.01).(6)PPAR-γ抑制剂(GW9662)组细胞磷酸化和非磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平显著高于AGE(10-1g/L)+阿托伐他汀(1 μmol/L)组(0.53±0.02比0.40±0.03和1.38±0.18比0.65±0.12,P均<0.01),MCP-1 mRNA表达水平显著高于AGE(10-1g/L)+阿托伐他汀(1 μmol/L)组(0.62±0.05比0.30±0.07,P<0.01).结论 阿托伐他汀可通过提高AGE诱导的人脐静脉内皮细胞对PPAR-γ表达抑制细胞NF-κB信号途径,进而抑制AGE诱导的人脐静脉内皮细胞的炎性反应.

Abstract：

Objective To investigate the effects of atorvastatin on advanced glycation end products (AGE) induced monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) expression in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and whether this effect could be linked to peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) and nuclear factor-κB(NF-κB).Methods Grouping: (1)Blank control group;(2)BSA group;(3)AGE group:cells were incubated with different concentrations of AGE(10-4,10-3, 10-2 and 10-1g/L)for 24 hours; (4)AGE+Atorvastatin group: cells were incubated with different concentrations of atorvastatin(0.1,1,10 μmol/L)for 1 hour,then incubated with AGE (10-1 g/L) for 24 hours; (5)PPAR-γ agonist(15 d-PGJ2)group: cells were incubated with 15 d-PGJ2(10 μmol/L)for 1 hour,then incubated with AGE (10-1g/L) for 24 hours;(6)PPAR-γ inhibitor(GW9662)group:cells were incubated with GW9662(5000 nmol/L)for 1 hour,then incubated with atorvastatin (1 μmol/L)and AGE (10-1g/L) for 24 hours. Collagenase was used to isolate the endothelial cell from human umbilical vein;RT-PCR was performed to examine the mRNA expression of MCP-1 and PPAR-γ;Western blot was performed to detect NF-κB p65 protein.Results (1) The expression of MCP-1 mRNA was increased in proportion with increasing concentrations of AGEs which could be blocked by atorvastatin in a dose-dependent manner. (2) AGE(10-1g/L)significantly downregulated the expression of PPAR-γ mRNA(0.22±0.08 vs. 0.69±0.09, P<0.01) while upregulated the expression of phospho-NF-κB p65 protein (0.78±0.06 vs. 0.31±0.01,P<0.01) and nonphospho-NF-κB p65 protein (1.61±0.16 vs. 0.59±0.14,P<0.01) comparaed with the control group which could be significantly attenuated by atorvastatin. (3) PPAR-γ agonist decreased the expression of phospho-NF-κB p65 protein (0.21±0.01 vs. 0.78±0.06, P<0.01),nonphospho-NF-κB p65 protein (0.67±0.14 vs. 1.61±0.16,P<0.01)and MCP-1 mRNA (0.17±0.02 vs. 0.93±0.12, P<0.01)compared with AGE(10-1g/L)group. (4) PPAR-γ inhibitor antagonized the effect of atorvastatin on the expression of phospho-NF-κB p65 protein, nonphospho-NF-κB p65 protein and MCP-1 mRNA stimulated by AGE in HUVECs(P<0.01).Conclusion The anti-inflammatory properties of atorvastatin in AGE stimulated HUVECs may partly be attributed to the effect on upregulation of PPAR-γ and downregulation of NF-κB signaling pathway.     

三氧化二砷对肝癌细胞表达PTTG1和VEGF的影响及其意义

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对人肝癌细胞株BEL-7402和SMMC-7721的作用及其可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测As2O3对两种细胞的生长活性;用流式细胞仪测定经不同浓度As2O3溶液处理后的两种细胞的周期变化,并用Annexin V-FITC与PI双染法检测细胞凋亡;用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测As2O3对两种细胞垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响;用蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测As2O3对两种细胞PTTG1和VEGF蛋白表达的影响.结果 As2O3可显著抑制BEL-7402和SMMC-7721细胞的生长,并呈量效关系(r=0.973,P<0.01;r=0.985,P<0.01),半数抑制浓度(IC50)分别为4.38 μmol/L和5.16 μmol/L.BEL-7402和SMMC-7721经As2O3处理后均发生显著凋亡(P<0.01).As2O3能显著下调两种细胞PTTG1和VEGF mRNA及蛋白的表达(P<0.01),并使细胞周期阻滞在G2/M期.结论 As2O3可有效抑制人肝癌细胞的生长增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期及下调PTTG1和VEGF的表达有关.     

澳洲茄胺盐酸盐在三氧化二砷诱导的HeLa细胞凋亡中的作用及对细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨澳洲茄胺盐酸盐(SBHL)在三氧化二砷(As2O3)诱导的HeLa细胞凋亡中的作用及对细胞端粒酶活性的影响.方法 采用细胞培养的方法体外培养宫颈癌HeLa细胞.用四甲基偶氮唑盐(MTT)法在SBHL(0,10,20,40,80,460,320 μmol/L)中筛选出最佳浓度.将HeLa细胞按1640培养液含As2O3和最佳SBHL浓度分为3组:对照组(0 μmol/L As2O3)、As2O3组(5 μmol/L As2O3)、As2O3+SBHL组(5μmoL/L As2O3+40μmol/L SBHL),培养时间分别为24、48、72 h.倒置显微镜下观察的HeLa细胞生长状况;透射电镜下观察HeLa细胞凋亡状况;MTT法检测HeLa细胞存活率;流式细胞术检测HeLa细胞周期和凋亡率;抗酒石酸酸性磷酸酶-酶联免疫(TRAP-ELISA)法检测HeLa细胞端粒酶活性的变化.结果 倒置相差显微镜下,对照组HeLa细胞排列密集,细胞呈圆形;As2O3组细胞数量减少,细胞间距逐渐增大;As2O3+SBHL组细胞收缩明显,细胞核碎裂为花瓣状,细胞间隙变得更大.电镜下,对照组Hela细胞表面有丰富的微绒毛,细胞间隔清晰,可见幼稚连接,连接不紧密,细胞核内多为常染色体,核仁清晰,核浆比约1∶1;As2O3组细胞超微结构呈现典型的凋亡特征,核内异染色质增多,染色质浓缩成块状,边集于核膜;As2O3+SBHL组细胞表面的微绒毛断裂、减少,核致密,呈块状分布,可见到凋亡小体.细胞存活率在24、48、72 h,组间比较差异均有统计学意义(X2分别为10.39、13.88、17.21,P均<0.05);在72 h,As2O3+SBHL组细胞存活率(52.80%)明显低于As2O3组(77.51%,X2=9.29,P<0.05).细胞周期G1期、S期组间比较差异有统计学意义(F值分别为7.46、22.14,P均<0.05);与对照组[(41.57±1.56)%、(50.45±2.37)%]比较,As2O3组[(27.10±5.32)%]和As2O3+SBHL组[(20.06±4.98)%]S期细胞减少(P<0.05或<0.01),G1期细胞增加[(58.70±5.18)%、(69.67±4.17)%,P<0.05或<0.01].细胞凋亡率组间比较差异有统计学意义(F=4.01,P<0.05);与对照组[(1.18±1.40)%]比较,As2O3组[(6.04±2.53)%]和As2O3+SBHL组[(21.08±1.22)%]细胞凋亡率明显升高(P<0.05或<0.01),其中As2O3+SBHL组高于As2O3组(P<0.01).端粒酶活性组间比较差异有统计学意义(F=21.28,P<0.05);与对照组(2.107±0.057)比较,As2O3组(1.214±0.621)和As2O3+SBHL组(0.865±0.284)细胞端粒酶活性降低(P均<0.05),其中As2O3+SBHL组低于As2O3组(P<0.05).结论 SBHL能促进As2O3诱导HeLa细胞凋亡,并能通过抑制端粒酶活性促进As2O3诱导HeLa细胞凋亡.

Abstract：

Objective To study whether solasodine hydrochloride (SBHL) could enhance the effect of arsenic trioxide in inducing apoptosis and affecting telomerase activity in cervical cancer HeLa cells. Methods Using cell culture methods, cervical cancer HeLa cells were cultured in vitro. The optimal concentration of SBHL was determined by MTT method from 0, 10, 20, 40, 80, 160, to 320 μmol/L. HeLa cells were grown in improved RPMI1640 supplemented respectively with arsenic trioxide(5 μmol/L As2O3), As2O3(5 μmol/L)+ SBHL( 40 μmol/L) and none (control group). The growth morphology of HeLa cells was observed under phase contrast microscopy after culture for 24, 48, and 72 h. Apoptosis of HeLa cells was determined under transmission electronic microscopy. The method of MTT was used to study the cell survival percentage. The technique of flow cytometry was used to measure cell cycle and cell apoptosis percentage. The method of tartrate-resistant acid phosphatase-enzyme linked immunosorbent assay (TRAP-ELISA) was used to determine telomerase activity of HeLa cells. Results Under phase contrast microscopy, in control group HeLa cells were round, densely packed; in As2O3 group the numbers of the cells were less, cell spacing increased; in As2O3 + SBHL group the cells shrinked significantly, nuclear fragmented as a petal-like, gap became larger. Under transmission electronic microscopy, there were rich microvillus on the cell surface in control group, cell intervals clear, immature connections, and the intervals did not close. The structure of the mitochondria in the cytoplasm was integrated. Most of the chromatin in the nucleus were, euchromatin and characteristics of apoptosis with heterochromatin increased and the chromatin condensed into masses, on the boundary of nuclear membrane. The microvillud on the cell surface were ruptured and decreased in As2O3 + SBHL group. The chromatin condensed into masses. The formation of apoptotic bodies was observed. The difference was statistically significant between groups in cell survival percentage at 24, 48, 72h(x2 = 10.39 , 13.88 , 17.21,respectively, all P < 0.05). Cell survival percentage in SBHL + As2O3 group (52.80%) was significantly less than that of As2O3 group(77.51%, x2 = 9.29, P < 0.05) at 72 h. In cell cycles, the difference was statistically significant between groups in C1 phase and S phase(F = 7.46,22.14, all P < 0.05), respectively. Compared with , control group[ (41.57 ± 1.56)%, (50.45 ± 2.37)%], cell percentages in S phase in As2O3 + SBHL group[(20.06 ± 4.98)%] and As2O3 group[(27.10 ± 5.32)%] were decreased(P< 0.05 or < 0.01), while cell percentage in C1 phase was increased[(58.70 ± 5.18)%, (69.67 ± 4.17)%, P< 0.05 or < 0.01]. The difference was statistically significant between groups in apoptotic percentage of HeLa cells (F = 4.01, P < 0.05). Compared with control group[ (1.18 ± 1.40)%], apoptosis percentage was significantly increased in As2O3 + SBHL group and As2O3 group [(21.08± 1.22)%, (6.04±2.53)%, P< 0.05 or < 0.01], respectively, and As2O3 + SBHL group was higher than As2O3 group(P < 0.01). The difference was statistically significant between groups in telomerase activity (F = 21.28, P< 0.05). Telomerase activity was inhibited in As2O3 group(1.214 ± 0.621) and As2O3A + SBHL group(0.865 ± 0.284) compared to control group (2.107 ± 0.057, all P < 0.05), and telomerase activity in As2O3 + SBHL group was lower than that of As2O3 group (P < 0.05). Conclusions SBHL enhances the effect of As2O3 in inducing apoptosis in HeLa cells, which is related to its inhibiting telomerase activity in HeLa cells.     

吡格列酮对成骨细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的 研究吡格列酮对成骨细胞增殖及凋亡的影响,并进一步了解其凋亡发生机制.方法 以MC3T3-E1成骨细胞株为实验对象,分别用0、5、10、20、30、40 μmol/L吡格列酮干预,观察细胞活性、细胞周期及凋亡率的变化,同时检测细胞Bcl-2,Bax蛋白表达.结果 随着浓度增加,成骨细胞的活性逐渐降低;与对照组相比,G0/G1,G2/M期细胞增多,S期细胞明显减少;凋亡率在5、10 μmol/L时低于对照组,30、40 μmol/L较对照组显著增高;Bax表达在10 μmol/L时明显减弱,20 μmol/L时回复到正常,30、40μmol/L较对照组显著增强;Bcl-2表达在浓度≤20 μmol/L时显著增强;对于Bax/Bcl-2相对表达强度与细胞凋亡率做相关性分析,两者呈显著性正相关(n=15,r=0.796,P＜0.01).结论 吡格列酮在低浓度抑制成骨细胞凋亡,对细胞起保护作用,较高浓度则促进细胞凋亡,Bax/Bcl-2参与其凋亡机制,并可能起关键调控作用.吡格列酮抑制成骨细胞DNA合成,抑制细胞增殖,导致细胞活性下降.

Abstract：

Objective To investigate the effects of pioglitazone on osteoblast proliferation and apoptosis.Methods MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells were treated with 0, 5, 10, 20, 30, and 40 μmol/L pioglitazone for 24 h. Cell viability was measured by MTT, cell cycle and apoptosis were inspected with flow cytometry, the expressions of Bcl-2 and Bax proteins were examined via immuno-chemical staining. Results Survival of osteoblasts decreased in a dose-dependent manner. Compared with the control group, the cells in the G0/G1 and G2/M stages increased, while the cells in S stage decreased significantly. The percentage of apoptosis at 5 and 10 μmol/L were lower than that of the control group(P ＜ 0.05), While it was increased significantly at 30 and 40 μmol/L(P ＜0.01). Bax expression was attenuated at 10 μmol/L(P＜0. 01), returned to normal by 20 μmol/L, and was increased by 30 and 40 μmol/L(P ＜ 0. 01). Bcl-2 expression was enhanced at the dose ≤ 20 μmol/L(P ＜0.01). Positive correlation was found between the death rate and the expression intensity of Bax/Bcl-2(n = 15, r=0.796, P＜0.01). Conclusions Pioglitazone inhibits apoptosis of osteoblasts at low concentrations and protects the cells, but promotes their apoptosis at higher concentration, Bax/Bcl-2 may play an important role in mediating the piglitazone-induced apoptosis of osteoblasts. It inhibits DNA synthesis and cell proliferation.     

罗格列酮抑制糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子及Smad的表达

目的 探讨糖基化终产物(AGE)对培养乳鼠心肌成纤维细胞增殖、结缔组织生长因子(CTGF)和Smad2、Smad4蛋白表达的影响及罗格列酮的干预作用.方法 采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取心肌成纤维细胞,应用MTT法、流式细胞仪法分别观察不同浓度AGE及罗格列酮对心肌成纤维细胞的细胞增殖、细胞周期的影响,ELISA方法 检测细胞培养上清中TGF-β1水平,Westem印迹技术检测CTGF及Smad2、Smad4蛋白质表达.结果 在一定浓度范围内,AGE干预心肌成纤维细胞,随浓度的增加,细胞增殖更加显著,TGF-β1分泌增加,CTGF蛋白表达增加.罗格列酮(0.1、1、10μmoVL)干预后,随浓度的增加,抑制心肌成纤维细胞增殖(分别为0.823±0.072、0.785±0.060、0.601±0.081对0.981±0.049,P<0.05)、抑制心肌成纤维细胞分泌TGF-β1(分别为257.77±9.09、230.29±6.56、200.84±10.26对300,68±8.56,P<0.01)、抑制CTGF蛋白表达的作用都更加显著(分别为0.769±O.108、0.590±0.095、0.534±0.115对1.021±0.113,P<0.01).罗格列酮(1和10μmol/L)干预后可显著减少AGE诱导的Smad2的蛋白表达(分别为0.424±0.059对0.572±0.073,P<0.05;0.396±0.080对0.572±0.073,P<0.01),同时可显著减少AGE诱导的Smad4的蛋白表达(分别为0.580±0.063对0.672±0.059,P<0.05;0.556±0.051对0.672±0.059,P<0.01).结论 AGE刺激心肌成纤维细胞增殖及分泌TGF-β1,同时诱导CTGF、Smad2及Smad4蛋白表达,罗格列酮在一定程度上抑制AGE上述作用,表明罗格列酮抑制心肌成纤维细胞增殖的效应与CTGF/Smad通路密切相关.