成体神经干细胞培养方法的建立

目的 探讨体外建立培养成体神经干细胞(MSC)的方法.方法 从6周龄大鼠脑组织中分离神经干细胞,用神经干细胞培养液[DMEM/F12培养液添加1%N2、2%B27、20 μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]使其稳定增殖,10%胎牛血清诱导其贴壁分化.倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE,成熟神经元的特异性标志)、半乳糖脑苷脂(Galc-C,成熟少突胶质细胞的标记物)的表达.结果 分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测显示Nestin阳性细胞为97.6%,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE、Galc-C阳性细胞.结论 采用无血清的神经干细胞培养液能培养出具有分化潜能的成体神经干细胞.     

应用旋转生物反应器和微载体技术体外大规模扩增人骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞 (ＭＳＣｓ)因其自身所具有的特殊性而日益受到关注[1,2 ] 。我们采用微载体技术在旋转生物反应器内扩增人骨髓间充质干细胞。一、材料与方法1.试剂 :细胞培养基ＤＭＥＭ购自美国Ｇｉｂｃｏ公司 ;旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ公司。2 .ＭＳＣｓ的分离与培养 :骨髓来源于正常献髓者 ,将人骨髓经ＤＭＥＭ稀释后用一种细胞分离液Ｐｅｒｃｏｌｌ分离 ,Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液的比重为 10 73 ｇ/Ｌ。分离后收获单个核细胞 ,ＤＭＥＭ洗 2次 ,接种于 2 4孔板内 ,浓度为 2 .0× 10 5个 /ｃｍ2 ,各孔内加入 10 %胎牛血清 …     

神经干细胞向神经元分化过程中EphrinB2基因的表达

神经干细胞(NSC)的分化调控使其向神经元分化,是将神经干细胞应用于中枢神经系统移植和替代治疗的关键。EphrinB2基因主要在神经细胞间相互作用、神经轴突导向和神经发育等方面具有重要的作用[1] 。本实验旨在研究EphrinB2基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导人胚胎神经干细胞向神经元分化过程中的表达和所起的作用。一、材料和方法Hoechst3 3 3 42、ATRA、DMEM、F12细胞培养基和N2添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ,美国Sigma公司)。表皮生长因子(EGF ,美国Invitrogen公司) ,小鼠抗人Nestin抗体(美国Bdbio science公司) ,小鼠抗…     

Lxn,bcl-2,c-myc在胰腺癌干细胞中的表达及意义

本研究通过免疫磁珠分选技术分选出胰腺癌细胞株Miapaca-2中的CD133+细胞,并检测lxn,bcl-2,c-myc在CD133+与CD133-细胞中表达,探讨其可能的生物学意义. 材料与方法 1.主要试剂:免疫磁珠分选设备及试剂(CD133Microbead Kit,human),流式抗体[CD133/2(293c3)-PE]均购自德国Miltenyi公司,兔抗人lxn多克隆抗体(ab103485),兔抗人bcl-2多克隆抗体(ab18210),鼠抗人c-myc单克隆抗体(ab32)均购自英国Abcam公司;鼠抗人β-actin单克隆抗体购自碧云天;Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)购自美国的Fermentas(MBI)公司;荧光实时定量PCR试剂盒(SYBR(R)Premix Ex TaqTM)购自大连宝生物公司;PCR引物序列由上海基康生物公司设计合成.     

骨髓间充质干细胞可分化为搏动的心肌细胞研究

骨髓间充质干细胞 (MSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞 ,在特定的条件下可向成骨细胞、软骨细胞、肌腱、肌细胞、脂肪细胞、骨髓基质细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及神经星状细胞分化[1 3 ] 。为此 ,我们进行了MSCs向心肌细胞的体外诱导分化的研究 ,为临床应用提供理论依据和技术支持。一、材料与方法1.试剂Percoll为Pharmacia公司产品。DMEM和 5 氮杂胞苷购自Sigma公司。α 横纹肌动蛋白免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物公司。胎牛血清(FBS)购自天津血液病研究所。2 .动物选择 :选用日本大耳白兔 48只 ,雌雄不限 ,年龄 3…     

爱茜蓝法检测组织工程化软骨及软骨细胞中蛋白聚糖的含量

我们应用爱茜蓝法对生物样品中蛋白聚糖进行定量测定 ,判断组织工程化软骨的生化构成是否正常。一、材料与方法1.试剂 :盐酸胍 (ＧｎＣｌ)、爱茜蓝和ＴｒｉｔｏｎＸ 10 0购自上海生工公司 ;硫酸软骨素购自Ｓｉｇｍａ公司 ;其他常用化学试剂均为分析纯。2 .体外培养软骨细胞样本制备 :软骨细胞取自幼年长枫白猪耳软骨 ,Ｈａｍ’ｓＦ12 (Ｇｉｂｃｏ公司 ,含 10 %胎牛血清、30 0ｍｇ Ｌ谷氨酰胺、5 0ｍｇ Ｌ抗坏血酸、青、链霉素各 10 0Ｕ ｍｌ)体外培养。取对数生长期软骨细胞 ,调整密度至 1× 10 6 个溶于 5 0 μｌ裂解液 ( 5 0ｍｍｏｌ ＬＴ…     

RNA干扰封闭AKT2增加人肝癌细胞对吉西他滨敏感性的研究

细胞凋亡的抑制可参与恶性肿瘤的进展和化疗药物耐药性的产生.因而诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前治疗恶性肿瘤的一项重要生物学策略.AKT2在体外培养的细胞中及体内均有阻止细胞凋亡的作用.为了探讨靶向封闭AKT2蛋白在肝细胞癌治疗中的意义和价值,我们建立AKT2表达减少的稳定细胞株SMMC7721-AKT2-shRNA,观察其对药物敏感性的变化. 材料与方法 1.主要试剂:兔抗人AKT2多克隆抗体购自CST公司、兔抗人bax多克隆抗体、兔抗人bcl-2多克隆抗体均购自SantaCruz公司;吉西他滨(Gem)购自Lilly公司;Supersilencing质粒购自上海吉玛制药有限公司;人肝癌细胞株SMMC7721苏州大学附属第一医院血研所提供.     

脑胶质瘤干细胞的培养和鉴定

肿瘤干细胞和肿瘤的发生、进展和预后密切相关[1].我们应用脑胶质瘤细胞株U251,证实人脑胶质瘤干细胞的存在. 一、材料与方法 1.材料:人脑胶质瘤细胞株U251(购自中国科学院细胞库).DMEM/F12培养基(Hyclone),EGF(Peprotech),FGF(Peprotech),LIF(Millipore),1327(Invitro-gen),鼠抗人Nestin单抗(中杉金桥),鼠抗人MAP2单抗(Sigma),鼠抗人PE-CD133单抗(eBioscience),兔抗人GFAP单抗(BIOSS),逆转录试剂盒(Toyobo),SYBR Green mix(Toyobo),等.     

大鼠脊髓源神经干细胞胶质细胞源性神经营养因子基因转染实验研究

目的　构建表达外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的脊髓源基因工程神经干细胞。方法　体外分离纯化,扩增大鼠脊髓源神经干细胞,培养、诱导分化结果采用Nestin、NF 2 0 0、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学鉴定;用自行构建的大鼠胶质细胞源性神经营养因子真核表达质粒转染神经干细胞,用荧光检测及GDNF免疫组织化学染色予以证实,转基因GDNF表达采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法定量分析。结果　体外纯化获得大量脊髓源神经干细胞,在血清诱导下能分化为神经元和神经胶质细胞;转基因神经干细胞能稳定表达GDNF ,在随后3周内,转基因神经球能持续表达外源性GDNF蛋白,表达量稳定在(93 .0±6.5 )ng/L左右。结论　胚胎脊髓源神经干细胞体外培养能保持干细胞生物学特点,转染GDNF后神经干细胞能稳定表达外源GDNF蛋白,为后续转基因治疗中枢神经系统疾病研究奠定了基础     

白藜芦醇与化疗药物体内体外合用对小鼠肝癌细胞生长的影响

本实验检测白藜芦醇单用及与化疗药物合用对体外培养鼠肝癌细胞株H2 2(腹腔接种传代 )生长的影响 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1.材料 :白藜芦醇购自Sigma公司(用二甲基亚酚溶解 ) ;小鼠肝癌H2 2细胞由本校免疫病理教研室提供 ,在含10 %小牛血清RPMI 164 0 (购于Gibco公司 )中培养 ;76只BALB/C小鼠 (购于西安交通大学医学院实验动物中心 )雌雄兼用 ;体重 (2 0± 2 ) g。 5 Fu购于西安交通大学第一医院西药房。2 .方法 :(1)将肝癌细胞H2 2细胞数(2× 10 4/孔 )接种在 96孔培养板上 ,在5 %CO2 、3 7.0℃培养箱中温育 12h后 ,分…     

应用bac-to-bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中重组表达CDNF蛋白

我们通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,在sf9昆虫细胞中诱导表达出重组CDNF蛋白,现报道如下. 一、材料与方法 1.材料:Cellfectin Ⅱ转染剂、SFM900Ⅱ基础培养基、Grace's Insect Cell Culture Medium(Unsupplemented)培养基购自Invitrogen 公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,质粒小量抽提试剂盒购自北京天根公司,蛋白相对分子质量Marker购自Ferment公司,抗His单克隆抗体购自北京中杉金桥生物公司,抗生素均购自Sigma公司,其他试剂均为国产分析纯.pFastBacHTb-CDNF为本室冻存,sf9昆虫细胞、DH10Bac感受态细胞购自Invitrogen公司.     

表皮生长因子对卵圆细胞p21ras蛋白表达的影响

卵圆细胞 (OVC)为肝脏的干细胞 ,与肝癌发生关系密切[1,2 ] 。我们应用Westernblot法通过对大鼠肝脏卵圆细胞在表皮生长因子 (EGF)干预下 p2 1ras表达的影响进行比较分析 ,同时运用四唑盐比色法 (MTT)法观察细胞活力 ,以揭示EGF对卵圆细胞活性及 p2 1ras蛋白表达变化的影响。一、材料与方法1.材料 :SD大鼠 6只 ,体质量 (12 0± 2 0 )g ,第一军医大学动物所提供。 3’ 甲基 4 二甲基偶氮苯 (日本东京化成工业株式会社 ) ,脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸 (美国Sigma公司 ) ,F12及DMEM /F12 (1∶1) (美国Gib co公司 ) …     

小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞混合培养的研究

外培目的观察小鼠雪旺细胞体养时对大鼠神经干细胞存活及分化的影响。方法获取Wistar鼠坐骨神经并采用组织块法分离和纯化雪旺细胞；体外分离新生乳鼠脑神经干细胞，将雪旺细胞和神经干细胞分别培养扩增后进行共培养。共分5组进行：实验组1（NSC悬浮＋SC悬浮＋DMEM／F12）；实验组2（NSC悬浮＋SC贴壁＋DMEM／F12）；试验对照组1（SC培养基＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组2（EGF／bFGF＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组3（NSC＋DMEM／F12）。倒置相差显微镜对各组培养细胞每天观察形态和计数，免疫组织化学检测混合培养细胞特异性标记物的表达：SC采用P0和S100，NS采用nestin标记，神经干细胞分化神经元分别采用GFAP、GalC、Tubulin-β染色。结果共培养组NF染色阳性神经元样细胞的百分率明显高干其他各组；实验组1克隆球直径明显高于其他各组，其平均直径为8μm；实验组神经元样细胞突起的长度比对照组的长，3周长度差为26．5-67．3μm。结论大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞共培养使两者不仅能够共生，而且雪旺细胞能显著促进体神经干细胞分化为神经元样细胞；神经干细胞分化神经元突起增长并且有序排列成轴索样结构。     

γ刀照射对胶质瘤细胞p16基因蛋白水平表达的影响

我们针对体外培养的胶质瘤细胞 ,在亚细胞水平探讨了肿瘤细胞γ刀照射后的凋亡机理 ,为以后研究提供依据 ,现报道如下。一、材料与方法1.主要试剂及来源 :培养基及蛋白酶为美国Ｆｌｕｋａ公司产品。小牛血清为长春生物制品所生产。兔抗鼠 ｐ16多抗(ＮＨ 46)为美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品。链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶染色试剂盒 (ＳＰ90 0 0 )为北京中山公司产品。2 .细胞培养 :Ｃ6细胞为高度恶性的胶质瘤细胞 ,购自美国生物菌种存储中心 (ＴＡＣＣ ,Ｐｏｃｋｖｉ ,ＭＤ ) ,接种于 2 5ｃｍ2培养瓶中单层培养。培养基含 10 %热灭活小…     

三种方法制作人脱细胞真皮基质的生物学特性比较

1材料与方法 1．1主要试剂 鼠抗人Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体，鼠抗人波形蛋白抗体，鼠抗人结蛋白抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；dispaseⅡ、Ⅰ型胶原酶、噻唑蓝（MTT）购白美国Sigma公司。     

转化生长因子-β1和结缔组织生长因子在慢性胰腺炎组织中的表达及其意义

我们通过建立大鼠慢性胰腺炎 (CP)模型 ,用免疫组织化学技术 ,对转化生长因子 β1(TGF β1)和结缔组织生长因子(CTGF)在CP形成过程中的表达进行动态观察 ,探讨其作用。一、材料和方法1.试剂与仪器 :三硝基苯磺酸Sigma公司产品 ,恒流静脉泵TE 3 11型 ,Teru mo公司产品 ,兔抗大鼠TGF β1单克隆抗体 ,兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体SantaCruz公司产品 ,兔抗大鼠CTGF单克隆抗体和EnVisionTM试剂盒购自Dako公司。2 .模型制备[1] :48只SD大鼠 (必凯公司 ) ,体重 2 5 0～ 3 0 0 g ,随机分为两组 :(1)CP组 (n =2 4)。氯胺酮 (10 0mg/kg)…     

新生大鼠脑源性神经干细胞培养方法的优化

目的寻求较理想的新生大鼠脑源性神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)分离培养方法。方法用不同的接种密度和多种配方的培养基:细胞种植密度采用1×104、1×105、1×106和1×107个/ml4个浓度;培养基除基础成分DMEM/F12外,按照是否添加2%B27、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)以及开始培养时胎牛血清浓度不同而分别记为第1～8组。分离培养新生大鼠脑源性NSCs并诱导其分化,应用相差显微镜和免疫细胞化学法对其进行观察和比较。结果分离培养出的细胞聚集成神经球,可在体外大量增殖和长期存活,可诱导分化为神经元和神经胶质,具有神经干细胞特性。开始培养时培养液中加入5%胎牛血清有利于NSCs存活,当血清浓度采用10%时,克隆球迅速分化,干细胞收获量极少;干细胞增生速度在种植密度采用1×106个/ml时优于采用其它种植密度时,适当提高其种植密度可加快增生速度;培养基中加入2%B27、bFGF、EGF是必需的,2%B27、20ng/ml的bFGF和EGF同时加入时NSCs生长最好,bFGF和EGF对加快NSCs的增生具有协同作用。结论成功建立了较理想的新生大鼠脑源性NSCs分离培养方法,为进一步研究和应用奠定了基础。     

胆囊癌血管生成关系与一氧化氮及碱性成纤维生长因子的研究

我们检测胆囊癌组织及正常胆囊组织中诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)及碱性成纤维生长因子 (bFGF)的表达及测定胆囊癌组织中微血管密度 (MVD) ,探讨一氧化氮 (NO)及bFGF与胆囊癌血管生成的关系。一、材料和方法1.临床材料 :收集本院 1997年 6月～ 2 0 0 1年 2月间经手术切除的胆囊癌标本 40例。标本经福马林固定 ,石蜡包埋 ,所有标本均经苏木素 伊红 (HE)染色病理证实。男 11例 ,女 2 9例 ,年龄(5 8.6± 12 .6)岁。另取正常胆囊组织 8例标本作为对照。2 .实验试剂 :兔抗人F Ⅷ相关抗原多克隆抗体购自美国Sigma公司 ,兔抗人iNOS多克…     

Menin在胃癌细胞中的表达

我们选取5株不同分化程度的人胃癌细胞,检测Menin的表达,现报道如下. 一、材料与方法 1.材料和细胞培养:Trizol、逆转录(RT)试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、荧光二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、Menin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH)抗体购自美国Santa公司.人胃癌细胞AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-28和人胃黏膜上皮细胞GES-1均为本实验室保存,细胞常规培养并进行后续实验. 2.RT-PCR检测:采用Trizol试剂,按说明书提取细胞总RNA,应用鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA并进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离,用Tanon-2500凝胶成像进行检测.