小鼠胚胎神经干细胞的长期培养和分化

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和分化条件,为神经干细胞的深入研究奠定基础。方法：无菌条件下分离小鼠胚胎脑皮质,制成单细胞悬液,种植在N2培养基中培养,培养基中加入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（每次实验用1－2只小鼠胚胎,实验重复8次）。采用机械方法传代,常规方法冻存和复苏。用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。结果：成功培养出小鼠的神经干细胞,神经干细胞呈悬浮状态生长,形成典型的神经球。细胞表达巢蛋白和波形蛋白2种神经干细胞的标志物。细胞在胎牛血清的诱导下,可分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,它们所占的比例分别为7％、85％－90％和2％－4％。结论:鼠的神经干细胞可以在体外稳定地培养和传代,为细胞治疗提供了一个理想的细胞来源。     

成年大鼠神经干细胞的体外培养和鉴定

1992年Reynolds和Weiss发现,在胚胎及成年中枢神经系统(central nervous system,CNS)室管膜下区,存在一群具有多向分化潜能和自我更新及克隆性扩增的细胞.近年来的研究发现,神经再生是成年哺乳动物大脑中普遍存在的现象,由成年神经干细胞进行的神经再生,对于生理状态下的多种神经活动和病理状态下大脑功能的修复有着重要意义.笔者从成年大鼠大脑海马中分离培养了具有干细胞特征的细胞,对成年神经干细胞进行了初步的研究.     

缺氧诱导小鼠神经干细胞诱导型一氧化氮合酶的表达

目的　探讨缺氧对小鼠神经干细胞 (NSC)中诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达的诱导作用。方法　用含表皮生长因子的培养基原代培养NSC ;用免疫组织化学法检测在急性缺氧诱导下iNOS的表达 ;在每张免疫组织化学图像中随机选取 10个细胞 ,用图像分析系统分析经不同缺氧时间处理后平均灰度级变化 ,其灰度级均数间接反映酶表达强度的改变。结果　原代培养的细胞能连续增殖并分化为神经元及神经胶质细胞样细胞 ;行免疫组织化学检测 ,在一般培养条件下 ,NSC及分化细胞中iNOS呈阴性表达 ;经缺氧处理后呈阳性表达。图像分析缺氧诱导 10、3 0min与非缺氧组灰度级均数分别为 :15 8.7± 5 .95、12 8.4± 5 .73、2 0 0 .3± 5 .5 5。结论　用缺氧方法能诱导NSC表达iNOS ,其表达强度与缺氧时间呈正相关。第四军医大学西京医院全军神经外科研究所     

神经干细胞的体外扩增及移植应用

长期以来人们认为中枢神经细胞是终末分化的细胞 ,近年已经从胚胎及成年中枢神经系统的不同部位分离并证实了神经干细胞的存在 ,并对其在不同条件下的增殖、分化特性做了较深入的研究 ,展示了其在移植应用方面的前景。1.神经干细胞及其分布干细胞目前尚无统一的定义。本文中神经干细胞是指中枢神经系统内未达到终末分化状态 ,能自我复制并能产生不同子代的细胞。巢蛋白 (ｎｅｓｔｉｎ)是新近发现的中间纤维 ,是哺乳动物神经干细胞的主要细胞骨架蛋白。Ｒｅｙｎｏｌｄ等[1] 将从胚胎第 14ｄ小鼠纹状体分离的单细胞进行克隆培养发现 :部分细胞…     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养和分化的研究

目的探讨脊髓源性神经干细胞的培养方法和体外分化特性. 方法从孕龄15天的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清限定性培养基培养并进行干细胞体外分化,细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果. 结果胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,培养10天左右可获得干细胞球;用细胞免疫荧光化学法鉴定干细胞分化,可见其中含有神经元和星形胶质细胞. 结论无血清限定性培养基是脊髓源性神经干细胞的良好培养基;脊髓源性神经干细胞体外可诱导分化为神经元和神经胶质细胞.     

大鼠神经干细胞体外培养及分化

神经干细胞（neural stem ceils,NSCs）是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞。它的发现是神经科学领域的重大进展,为神经发育研究与神经组织移植开辟了广阔的前景,在将来治疗诸如帕金森氏病等神经退行性疾病和神经损伤性疾病上有较为广泛的应用。源于人脑能不断增殖的神经干细胞对基础与临床神经科学尤其具有巨大的诱惑力,神经干细胞的长期分离培养与建系成为进一步中枢神经系统疾病治疗研究的首要任务。     

成体神经干细胞培养方法的建立

目的 探讨体外建立培养成体神经干细胞(MSC)的方法.方法 从6周龄大鼠脑组织中分离神经干细胞,用神经干细胞培养液[DMEM/F12培养液添加1%N2、2%B27、20 μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]使其稳定增殖,10%胎牛血清诱导其贴壁分化.倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE,成熟神经元的特异性标志)、半乳糖脑苷脂(Galc-C,成熟少突胶质细胞的标记物)的表达.结果 分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测显示Nestin阳性细胞为97.6%,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE、Galc-C阳性细胞.结论 采用无血清的神经干细胞培养液能培养出具有分化潜能的成体神经干细胞.     

睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响。方法：采用Percoll密度梯度分离及差速贴壁法纯化精原干细胞,用免疫荧光染色及流式细胞检测对小鼠精原干细胞进行鉴定。设置实验组和对照组,两组均以支持细胞作为饲养层培养精原干细胞,在实验组DMEM／F12完全培养液中添加睾酮。用酶联仪检测细胞的生长情况;用流式细胞仪对细胞生长周期进行判断;采用ICSI技术让精子细胞与卵母细胞结合,观察卵裂细胞数,体外培养3天后进行染色体形态与数量分析。结果：在添加睾酮的培养基中培养的精原干细胞,其OD值增长较快（P〈0．05）;精原干细胞DNA合成期（S期）的含量增多（P〈0．05）;精子细胞与卵子结合以后可得到二倍体配子。结论：睾酮能促进精原干细胞的体外增殖与分化。     

BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的：研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法：从12周龄人胚胎脑皮质分离细胞，采用无血清培养技术，协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(ECF)和重组人白血病抑制因子(rhLIF)进行培养；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记检测细胞的增殖能力，间接免疫荧光化学法检测细胞的分化情况。结果：培养得到的大量半悬浮生长的神经干细胞球能够传代培养；BrdU标记阳性，可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：人胚胎脑皮质分离细胞培养得到的细胞群具有神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性

目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（adipose derived stem/stromal cells,ASCs）,对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。方法：将腹部取皮术的皮下脂肪利用胶原酶消化法,进行体外分离培养,取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、流式鉴定、MTT、细胞周期检测等,利用成脂和成骨培养液诱导,油红O和茜素红染色鉴定诱导结果。结果：原代培养第1次换液时细胞多呈多角形和短梭形,第3代ASCs细胞爬片HE染色显示形态多为长梭形,呈漩涡状生长;流式鉴定显示：CD29＋,CD31-,CD34-,CD44＋,CD45-,CD49＋,CD106-,CD133-;MTT显示ASCs生长增殖活性强;细胞周期检测结果显示：G1=86.8%,G2=8.77%;成脂诱导后油红O染色阳性,对照组为阴性;成骨诱导后茜素红染色阳性,对照组为阴性。结论：人ASCs具有贴壁生长、多向分化以及干细胞表型等特征,且生长增殖活性强,是一种很有应用前景的间充质干细胞。     

小鼠精原干细胞体外培养体系的建立

目的:建立小鼠精原干细胞体外扩增的培养体系。方法:取出生后2~6d的雄性ICR小鼠30只,脱颈法处死,切取睾丸后,采用两步酶消化法制成单细胞悬液,添加特定培养液,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养。培养后通过BrdU整合实验检测其增殖能力,并用碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定。结果:小鼠精原干细胞在体外稳定增殖,所得克隆AP强阳性,标记物检测GFRα-1+/Oct-4+/VASA+/SCP3-,基因表达GFRα-1+/Oct-4+/SCP3-,证实所培养细胞为处于未分化状态的小鼠精原干细胞。结论:在本研究建立的培养体系下小鼠精原干细胞可稳定传代并保持未分化状态,为探索体外精子发生过程提供了良好的研究平台。     

人骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定的实验研究

目的观察体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的形态和生长规律,以证实人MSCs是一种理想的种子细胞,以及为进一步深入研究提供基础理论依据。方法对人骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯MSCs。观察原代、传代细胞的结构、生长情况,对第2代MSCs表面抗原进行测定。结果MSCs原代培养第14～16d时细胞融合成单层,传代细胞保持原代细胞的形态特征。超微结构显示:第2代MSCs细胞核形态不规则,部分核可见多个核仁,胞质内细胞器形态分化幼稚。细胞的生长曲线显示:传代第3d起呈对数生长,第5d达到高峰,10代后无明显克隆出现。P1代克隆形成率为25.83%±2.93%,P5代为14.67%±1.63%,P10代为4.67%±0.52%。MSCs的表型特征显示细胞均一性较好,MSCs表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。结论用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选法,可分离、纯化人MSCs,方法简单、经济,易应用;MSCs增殖能力强,可在体外大量扩增,能满足组织工程的要求,是理想的种子细胞之一。     

CD34阳性兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的 探讨兔真皮干细胞的体外分离培养和鉴定方法,初步对其生长特性进行研究,并为生物组织工程提供一种新的种子细胞及成熟的分离鉴定方法.方法 以新生新西兰大白兔为研究对象,机械法直接分离得到真皮组织,采用酶消化法获取细胞,利用干细胞贴壁黏附生长的特性获取高克隆细胞群,并进行传代筛选.应用流式细胞技术检测细胞周期,成骨诱导检测其分化潜能,免疫细胞化学法检测细胞表面分子的表达.结果 原代培养的兔真皮细胞经过连续传代培养至第3代,细胞形态均一.流式细胞仪细胞周期分析显示,体外培养3 d时DNA合成前期细胞(G1期)为55.8%,DNA合成期细胞(S期)为34.6%.免疫细胞化学显示:细胞表面波形蛋白(vimentin)、CD34表达阳性,细胞角蛋白19(cytoKeratin19)、Ⅷ因子和巢蛋白(nestin)表达阴性.结论 新生新西兰大白兔真皮组织中存在多能干细胞,该细胞可向成骨细胞分化,具有多向分化潜能.     

猕猴骨髓基质干细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的 通过体外分离、培养猕猴骨髓基质干细胞(BMSCs)，研究其生物学特性、表面标志和遗传学性能，为BMSCs用作组织工程化神经种子细胞提供研究基础。方法 通过密度梯度离心分离猕猴BMSCs，体外培养、扩增，用倒置相差显微镜进行形态学的观察，通过绘制生长曲线、计算克隆形成率来研究细胞的活力和增殖能力，流式细胞仪检测表面标志，核型分析反应遗传学性能。结果 密度梯度离心的方法能获得较纯的猕猴BMSCs，第7代以前的细胞有较强的活力和增殖能力，具有与人的BMSCs相似的形态和表面标志，体外培养第10代细胞仍稳定为二倍体核型。结论 用本实验方法能较容易地获得大量的猕猴BMSCs，具有与人的BMSCs相似的形状和表面标志，第3—6代的细胞可满足以猕猴为动物模型的组织工程化神经种子细胞的研究要求。     

表皮干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养和鉴定人表皮基底层干细胞。方法中性蛋白水解酶选择性的消化表皮与真皮之间的细胞连接,采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离、培养表皮中的干细胞,观察培养第2、4、6天时a6、β1整合素、K19、K14、p63、Nestin、CD34、PCNA及K10在表皮干细胞中的表达差异。结果改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够有效地促进表皮干细胞的贴壁和伸展。原代分离的表皮基底层干细胞a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA表达为强阳性而K10不表达。这些细胞具有干细胞的特点,可以形成克隆。随着培养时间的增加,表皮干细胞形态发生变化,a6、β1整合素、K19、K14,表达逐渐减弱,K10表达逐渐增强。此外,在原代分离的细胞中可见单个核样干细胞表达a6、β1整合素,K19,K14,p63,Nestin,CD34及PCNA,这些细胞形态相似体积较表皮基底层干细胞大,胞核为肾形,染色较深。结论中性蛋白水解酶消化合并改良过的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法能够高效地分离表皮中的干细胞。分离的细胞具有干细胞的特点,可以形成集落。此外,原代分离培养的表皮干细胞中仍然可见单个核样干细胞,这些细胞形态相似,类似血液系统来源的单核细胞,胞质内均匀分布着粗大的阳性颗粒。单个核样干细胞可能与皮肤的发生、发育以及创伤修复有关。     

猪跟腱止点纤维软骨细胞的分离、体外培养及鉴定

[目的]探讨猪跟腱止点纤维软骨层细胞的分离、培养及鉴定方法,观察纤维软骨细胞的生物学特性。[方法]体视显微镜下切取贵州迷你小香猪跟腱止点纤维软骨层组织并剪碎,经过胰蛋白酶和II型胶原酶两步酶消法,后在含10%FBS的DMEM进行培养和传代,使用HE、阿利新蓝、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。[结果]成功分离获得纤维软骨细胞。鉴定证实实验细胞具有纤维软骨细胞共同生物学特性。HE染色:细胞浆蛋白多糖成分被染成深浅不同的粉红色;阿利新蓝染色:纤维软骨细胞内见蓝紫色异染颗粒,细胞核深染,细胞周围有少量异染颗粒出现。Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:纤维软骨细胞胞质被染成棕黄色。[结论]成功分离和培养了猪跟腱止点纤维软骨层细胞,针对纤维软骨细胞特性,通过不同染色方法进行了联合鉴定。本实验建立的腱止点纤维软骨细胞分离、培养方法是一种简便可靠的方法。     

神经干细胞的分离培养及体外分化

目前 ,脊髓损伤的修复和治疗 ,仍然是一个难以解决的世界性难题。虽然在动物实验中已取得了一些令人鼓舞的进展 ,但至今未找到一种能用于临床的有效方法。神经干细胞(neuralstemcells ,NSCs)的发现为中枢神经系统 (centralner voussystem ,CNS)损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望。因其具有很强的分裂、增殖和自我更新能力 ,人们把它视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料。近年来神经干细胞的研究作为生命科学界的热点受到广泛关注。本文就神经干细胞的分离、培养及其体外分化作一综述 ,重点在于人神经干细胞的研究。1　啮齿动…     

人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染

目的：探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性。方法：利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞，以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基，通过角蛋白19（K19）和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定，对培养细胞进行鉴定。采用脂质体介导法，以含血管内皮细胞生长因子165（VEFG165）基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞；采用病毒载体介导法，以含报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的重组腺相关病毒载体（raav/GFP)转染培养细胞。应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果。结果：人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长、克隆形成率高，G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞，K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性。pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性，raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光。结论：利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基，可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养。以质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的。     

小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的  探讨小鼠羊水间充质干细胞（AF-MSC）的分离、培养及鉴定。方法  在无菌条件下获取孕鼠子宫,收集羊水后进行过滤和离心,对沉淀细胞团进行培养并传代。观察AF-MSC的形态,分析AF-MSC的增殖特点,采用流式细胞术鉴定AF-MSC的表面标志物,检测AF-MSC的三系分化能力及冷冻复苏后的细胞活力。结果  小鼠AF-MSC呈典型的梭形,融合度 > 80%时会出现典型的漩涡状结构。小鼠AF-MSC传代培养无明显潜伏期,培养2~3 d进入对数增长期,增长速度最快,之后增殖速度减慢,进入平台期。AF-MSC表达干细胞抗原（Sca）-1、CD29、CD44,不表达CD34、CD45。小鼠AF-MSC成骨分化后,矿化结晶被茜素红染成深红色的点状;成软骨分化后,分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色;成脂分化后,胞质脂滴被油红O染成红色。细胞冷冻复苏后存活率 > 95%,生长状态良好,6 d时增殖能力高于冻存前（P < 0.05）,其他时间增殖能力与冻存前比较,差异无统计学意义（均为P > 0.05）。结论  本实验成功分离了小鼠AF-MSC,过程简便、成本低,且分离的细胞可随传代次数的增加而纯化,冻存不影响其增殖能力。