鞘内注射PKC抑制剂对神经病理痛大鼠脊髓背角NMDAR、CGRP表达的影响木

目的:观察鞘内注射PKC抑制剂对神经病理痛大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨受体(NMDAR)、降钙素基因相关肽(CGRP)表达的影响.方法:健康雄性SD大鼠36只,体重220～280g.随机分为4组(n=9):对照组(C组)、假手术组(Sham组)、坐骨神经分支选择结扎切断模型组(SNI组)和PKC抑制剂组(P组).SNI组和P组制备SNI模型,P组在SNI术后14d内每天鞘内注射PKC抑制剂11μg,其余各组给予等容量生理盐水.在SNI术前ld(基础值)及术后14d每次注射药物后测定机械痛阈和热缩足潜伏期,分别于SNI术后2、7、14d注射药物后各处死大鼠3只,采用免疫组化法测定L5节段脊髓背角NMDAR和CGRP表达水平.结果:与C组和Sham组比较,SNI组机械痛阈降低,NMDAR和CGRP表达上调(P<0.01),热缩足潜伏期差异无统计学意义(P>0.05).与SNI组比较,P组机械痛阈升提高,热缩足潜伏期延长,NMDAR和CGRP表达下调(P<0.01).结论:鞘内注射PKC抑制剂对神经病理痛大鼠具有明显的抗伤害效应,并抑制大鼠脊髓背角NMDAR和CGRP表达.     

高浓度医用臭氧对大鼠运动功能和脊髓Bax、Bcl-2表达的影响

目的:观察鞘内注射高浓度医用臭氧对大鼠运动功能和脊髓组织中Bax、Bcl-2基因表达的影响.方法:SD大鼠16只,随机均分为2组(n=8),分别建立大鼠鞘内置管模型.对照组(C组)仅行鞘内穿刺置管不注射;医用臭氧组(O3-60组):鞘内置管后经导管注射60 μg/mL医用臭氧10 μL.麻醉前及注射医用臭氧后24 h分别对两组大鼠进行BBB运动功能评分;然后立即断颈职材,采用Western blot测定腰膨大处脊髓组织Bax、Bcl-2蛋白表达水平.结果:与对照组相比,鞘内注射高浓度医用臭氧24 h后,臭氧组大鼠后肢BBB运动功能评分(Basso Beattie and Bresnahan locomotor rating scales,BBB scores)显著降低(P＜0.05);脊髓Bax蛋白表达显著增加(P＜0.05),Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.05).结论:高浓度医用臭氧鞘内注射可损伤大鼠运动功能,其损伤可能与神经细胞凋亡有关.     

芍药苷通过抑制脊髓CC趋化因子配体2拮抗吗啡镇痛耐受

目的探讨脊髓CC趋化因子配体2(CCL2)在芍药苷拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用。方法成功鞘内置管清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,随机分为4组(n=15):生理盐水组(NS组),吗啡组(MOR组),芍药苷组(PF组)和吗啡+芍药苷组(MOR+PF组)。连续7d鞘内注射15μg吗啡建立慢性吗啡耐受的动物模型。应用甩尾潜伏期法(tail flick latency,TFL)及机械反射阈值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)观察鞘内注射芍药苷对吗啡镇痛耐受的影响;应用免疫组织荧光染色法检测芍药苷对腰段脊髓小胶质细胞活化的影响;应用免疫印迹法(Western blot)检测芍药苷对腰段脊髓CCL2表达的影响。结果连续7d鞘内注射吗啡后,与NS组比较,MOR组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著增多,腰段脊髓CCL2表达显著增加(P0.05);而与MOR组比较,MOR+PF组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著减少,腰段脊髓CCL2表达显著减少(P0.05)。与MOR组大鼠最大镇痛效应百分率(percent of maximal possible potential effect,MPE)比较,MOR+PF组大鼠%MPE显著增加(TFL:19%±4%vs 41%±3%;MWT:18%±6%vs 42%±4%,P0.05)。结论芍药苷可能通过抑制脊髓内CCL2表达增加拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受。     

鞘内预注布托啡诺与吗啡对炎性痛大鼠痛觉及脊髓c-fos蛋白表达的影响

目的观察鞘内预先注射布托啡诺与吗啡对福尔马林诱导的炎性痛大鼠疼痛行为学及脊髓c-fos蛋白表达的影响。方法大鼠被随机分为布托啡诺组、吗啡组及对照组,每组8只。布托啡诺组鞘内预先注射布托啡诺10μg,吗啡组鞘内预先注射吗啡10μg,对照组鞘内预先注射0.9%氯化钠注射液,然后在三组大鼠的左后足掌面皮下注射福尔马林致痛,观察各组大鼠行为学变化并通过免疫组化法测定大鼠腰4~6节段脊髓背角c-fos受体的表达。结果与对照组比,吗啡组和布托啡诺组没有明显的福尔马林致痛双相反应,且福尔马林致痛大鼠腰4-6脊髓背角浅层及深层fos样免疫反应神经元(FLIN)数量明显减少(q分别=5.65、4.78;5.85、6.27,P均<0.05),而与吗啡组比较,布托啡诺组大鼠行为学表现更安静,疼痛加权评分减低,脊髓背角浅层及深层FLIN数量也明显减少(q分别=9.53、6.37,P均<0.05)。结论鞘内预先注射布托啡诺与吗啡能够对福尔马林致痛大鼠产生明显的抗伤害和镇痛作用,且布托啡诺的镇痛效果优于吗啡。     

鞘内单次注射吗啡对神经病理痛大鼠脊髓背角CGRP表达的影响

目的:观察鞘内单次注射吗啡对神经病理痛大鼠脊髓背角降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide CGRP)表达的影响.方法:20只健康雄性SD大鼠,体重200～270 g,随机分为4组:对照组(C组,n=5),假手术组(S组,n=5),生理盐水组(N组,n=5),吗啡组(M组,n=5).C组不做任何处理,其它3组均根据改良Yaksh法进行鞘内置管;N组和M组制备神经病理痛模型(SNI模型),制模2 d后,N组和M组分别鞘内注射生理盐水和吗啡10μg,容量为20μl.每组均在SNI术前1d(基础值)到术后2d内每天测定机械痛阈和热缩足潜伏期,并全部在注药后2h处死大鼠,用免疫组织化学方法观察大鼠L5节段水平脊髓背角CGRP的表达.结果:与C组和S组比较,N组机械痛阈降低,CGRP表达上调(P<0.05),热缩足潜伏期差异无统计学意义(P0.05).与N组比较,M组机械痛阈升高,热缩足潜伏期延长,CGRP表达下调(P<0.05).结论:鞘内单次注射吗啡对神经病理痛大鼠在产生镇痛效应时引起脊髓背角CGRP表达下调.     

鞘内泵入布托啡诺对神经病理性疼痛大鼠脊髓P物质表达的影响

目的:观察鞘内泵入布托啡诺对神经病理性疼痛大鼠脊髓P物质的影响,探讨鞘内泵入布托啡诺治疗神经病理性疼痛的可行性.方法:24只SD大鼠随机分为3组,空白对照组(B组),不实施任何手术;对照组(C组),右肢制备坐骨神经慢性压迫损伤模型(CCI)及鞘内置管后鞘内泵入生理盐水10μL/d;布托啡诺组(TB组),CCI及鞘内置管后泵入布托啡诺24μg/d.C组和TB组术后第4天开始鞘内给药,连续给药7 d.第11天于给药2 h后大鼠灌注固定,采用免疫组化方法检测脊髓背角P物质.结果:成功制作CCI模型,无鞘内导管脱出现象,且注药成功,无疼痛行为学差异.与B组相比,C组和TB组脊髓背角P物质表达明显增加(P＜0.01);与C纽相比,TB组脊髓背角P物质表达明显降低(P＜0.01).结论:鞘内泵入布托啡诺可以通过减少脊髓P物质表达而发挥镇痛作用,布托啡诺可以通过鞘内给药治疗神经病理性疼痛.     

P2X_3受体的上调参与大鼠吗啡耐受的发生

目的:观察鞘内注射吗啡对背根神经节(DRG)神经元中P2X3受体的激活和表达的影响,同时探讨合并应用P2X3受体特异性抑制剂A-317491对大鼠鞘内吗啡耐受的影响。方法:鞘内置管成功的SD大鼠随机分为六组,每组7只:M3组,吗啡3天,每天单次鞘内给15μg/10μl吗啡,继而用10μl生理盐水冲管;M5组,吗啡5天(剂量及给药方式同前);M7组,吗啡7天(剂量及给药方式同前);M+A组,A-317491合并吗啡7天,每天单次鞘内注射抑制剂A-317491(15μg/10μl),30 min后给吗啡(15μg/10μl),每次给药后用10μl生理盐水冲管;A组,A-317491 7天,每天单次鞘内给抑制剂A-317491(15μg/10μl),继而用10μl生理盐水冲管,连续7天;S组,每天单次鞘内给20μl生理盐水。每次给药前及给药后30 min动态检测大鼠后肢50%缩爪阈值,以及热痛阈甩尾潜伏期,以评估吗啡耐受的发生。于给药后第8天测定痛阈后将大鼠处死,取L3~5节段背根神经节(DRG)进行蛋白印记和免疫荧光化学染色,观察DRG中P2X3的蛋白及免疫阳性细胞表达。结果:(1)鞘内给予P2X3受体特异性拮抗剂A-317491可明显延缓大鼠吗啡耐受的发展;(2)鞘内给予吗啡可致大鼠脊髓背根神经节中P2X3受体的表达呈时间依赖性的增加;3、慢性鞘内吗啡处理可激活DRG神经元中P2X3受体的表达,而给予A-317491后可以抑制这种表达的增加。结论:鞘内慢性吗啡处理可激活大鼠DRG神经元中的P2X3受体的表达,而选择性抑制P2X3受体可一定程度上抑制吗啡耐受的发生。     

慢性给予BAM8-22对吗啡镇痛作用的影响

目的:探讨慢性激活脊髓感觉神经元特异性受体(sensory neuron-speci?c receptor,SNSR)对吗啡镇痛作用的影响。方法:雄性SD大鼠分为3组:第1组连续6 d鞘内注射生理盐水,第7天足底注射2.5%福尔马林(Formalin);第2组连续6 d鞘内注射生理盐水,第7天给吗啡(15μg)处理,再足底注射Formalin;第3组连续6 d鞘内注射SNSR特异性激动剂牛肾上腺髓8-22(Bovine adrenal medulla 8-22,BAM8-22)10 nmol,第7天先吗啡处理,再足底注射Formalin。第7天检测痛行为和脊髓背角c-Fos、NADPH的表达。结果:鞘内注射吗啡能够抑制Formalin引起的痛行为和脊髓背角c-Fos、NADPH的表达,鞘内连续6 d给予BAM8-22后,吗啡对Formalin诱发痛行为和脊髓背角c-Fos、NADPH增加的抑制作用大大减弱。结论:持续刺激SNSR,能削弱μ-阿片受体的功能。     

胰岛素强化治疗拮抗烫伤大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨大鼠重度烫伤后胰岛素强化治疗拮抗心肌细胞凋亡的作用及机制.方法 将18只SD大鼠按随机数字表法分为假伤组、烫伤组和胰岛素强化治疗组(强化治疗组),每组6只.制作30％总体表面积(TBSA)Ⅱ度烫伤模型及胰岛素强化治疗模型.伤后6h取大鼠左室心肌组织,采用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡,用免疫组化和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分别观察3种凋亡相关基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果 与假伤组比较,烫伤后心肌凋亡细胞明显增多[(13.1±3.4)％比(0.6±0.4)％,P＜0.01];caspase-3、Bax的蛋白表达明显增高(免疫组化caspase-3:13.72±4.13比1.36±0.95,Bax:29.64±5.42比2.24±1.04; Western blotting caspase-3:5.72±2.13比1,Bax:4.64±1.42比1),而Bcl-2表达水平显著降低(免疫组化:3.39±1.52比8.01±2.56;Western blotting:0.69±0.42比1,均P＜0.01).经胰岛素强化治疗后,心肌细胞的凋亡率较烫伤组明显降低[(6.7±1.8)％比(13.1±3.4)％,P＜0.01],3种凋亡相关基因的蛋白表达水平正好与烫伤组的变化相反(免疫组化caspase-3:8.88±3.36比13.72±4.13,Bax:14.43±3.69比29.64±5.42,Bcl-2:8.61±3.72比3.39±1.52;Western blotting caspase-3:2.18±0.86比5.72±2.13,Bax:2.87±1.35比4.64±1.42,Bcl-2:3.57±1.70比0.69±0.42,P＜0.05或P＜0.01).结论胰岛素强化治疗可能通过调节caspase-3、Bax和Bcl-2 3种细胞凋亡相关基因的表达,对烫伤后心肌细胞发挥抗凋亡作用.     

托吡酯对大鼠脊髓损伤后神经的保护机制

目的:观察托吡酯(TPM)对大鼠脊髓损伤(SCI)后氧化应激及细胞凋亡的影响.方法:采用改良Allen's法制作大鼠SCI模型,随机分为假手术组、模型组及TPM低、中、高剂量组,采用BBB评分及斜板试验评价各组大鼠后肢运动功能的改变,HE染色观察脊髓形态学变化,紫外分光光度计检测大鼠脊髓组织丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,Western blot法观察脊髓B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达情况.结果:伤后各组BBB评分及斜板试验结果显著下降,1d、3d各组间差异不显著(P＞0.05),伤后5d高剂量组恢复情况显著优于低、中剂量组及模型组(P＜0.05);伤后14d时各组脊髓切片HE染色示高剂量组脊髓病理改变明显轻于低、中剂量组及模型组;与模型组比较,SCI后24h高剂量组MDA含量显著降低(P＜0.01),GSH含量显著增加(P＜0.01):高剂量组Bcl-2表达上调(P＜0.01),而Bax表达下调(P＜0.01).结论:TPM可有效降低SCI后的氧化应激水平,抑制细胞凋亡,减轻脊髓继发性损害,促进SCI后神经功能的恢复.     

人锌指蛋白23在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的 分析hZNF23在人HCC组织及HepG2细胞系中的表达情况,以探讨其与HCC临床病理特征和细胞凋亡的关系.方法 采用实时荧光定量RT-PCR法检测37例HCC患者(按Edmondson分为两组,Ⅰ+Ⅱ级17例,Ⅲ+Ⅳ级20例;按临床分为3组,HCC合并肝硬化和HBV感染组31例,HCC合并肝硬化和HCC合并HRV感染组各3例)癌组织和其癌旁肝组织标本中hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平,并分析其与HCC临床病理特征的关系;体外培养HepG2细胞后,分为4组(对照组、1.25、2.5和5 μg/ml顺铂组)或6组(对照组、1.25、2.5、5、10和20μg/ml顺铂组).采用四唑盐比色法(MTT)和流式细胞仪膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测与观察HepG2细胞的增殖及凋亡情况;实时荧光定量RT-PCR法检测HepG2细胞在不同浓度的顺铂诱导凋亡后,hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平.结果 37例HCC患者癌组织及其癌旁组织标本中hZNF23相对表达量分别为8.84(3.59～15.05)和22.20(13.85～42.90),差异有统计学意义(U=259.5,P＜0.01).Edmondson Ⅰ+Ⅱ级HCC组织hZNF23 mRNA相对表达量为12.80(4.80～19.50),高于Ⅲ+Ⅳ级的5.01(2.88～11.68),且差异有统计学意义(U=99.00,P＜0.05);合并肝硬化组为9.92(3.80～15.25),未合并肝硬化组为3.21(2.78～3.60)、合并HBV感染组为9.09(3.72～15.25),无HBV感染组为2.48(1.79～12.10),合并肝硬化组与未合并肝硬化组、合并HBV感染组与未合并HBV感染组比较,其hZNF23 mRNA表达量差异均无统计学意义(U值分别为16.00和24.00,P均＞0.05).顺铂作用于HepG2细胞24 h后,用MTT检测,顺铂明显抑制HepG2细胞增殖;膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率依次为(0.9±0.2)%、(4.2±0.3)%、(9.8±4.3)%、(23.0±6.0)%,顺铂显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈剂量依赖性(F=27.890,P＜0.01).实时荧光定量RT-PCR法检测1.25、2.5、5μg顺铂诱导的HepGR细胞组hZNF23 mRNA相对表达量依次为(10.39±3.08)×10-5、(24.10±2.09)×10-5、(6.90±2.24)×10-4,均显著高于对照组[(9.48±1.80)×10-5,F=6.027,P＜0.01].结论 HCC组织中hZNF23相对表达水平与Edmondson分级密切关联;顺铂对HepG2细胞的凋亡作用可能与hZNF23上调有关.

Abstract：

Objective To detect the expression level of human zinc finger 23 (ZNF23) in hepatocellular carcinoma tissue samples and HepG2 cell lines and investigate the relationship between hZNF23 expression and clinicopathological characteristics of HCC and cell apoptosis. Methods The expression levels of hZNF23 and GAPDH mRNA in 37 cases of HCC were measured by real-time RT-PCR. The association between the expression of hZNF23 and the clinicopathological characteristics of HCC was analyzed. Cultured HepG2 cells were divided into 4 groups ( control group, 1.25 μg/ml , 2.5 μg/ml and 5 μg/ml cisplatin)or 6 groups( control group, 1.25 μg/ml, 2.5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml and 20 μg/ml cisplatin). MTT method was employed to evaluate cell proliferation. Annexin V-FITC assay was used to assess percentage of apoptotic HepG2 cells. The expression levels of hZNF23 and GAPDH mRNA of HepG2 cells after apoptosis induced by cisplatin with a series of concentrations were measured by real-time RT-PCR.Results The median ( quartile1, quartile 3) expression levels of hZNF23 mRNA in 37 HCC tissue samples and adjacent tissue samples were 8.84 (3.59-15.05), 22.20 ( 13.85-42.90 ), respectively. There was significant difference ( U = 259.5, P ＜ 0.01 ). The median ( quartile1, quartile 3 ) expression levels of hZNF23 mRNA in cancer tissue samples with Edmondson stage Ⅰ + Ⅱ [12.80(4.80-19.50)] was much higher than those in stage Ⅲ + Ⅳ [5.01 ( 2.88-11.68 ), U = 99.00, P ＜ 0.05] The median ( quartile1,quartile 3 ) expression levels of hZNF23 mRNA in patients with and without hepatic cirrhosis were 9.92(3.80-15.25) , 3.21 (2.78-3.60), respectively. The median ( quartile1, quartile 3 ) expression levels of hZNF23 mRNA in HBV infection and non-infection patients was 9.09(3.72-15.25 ), 2.48 (1.79-12.10),respectively. There was no significant difference between groups with and without hepatic cirrhosis and between HBV infection and non-infection groups( U = 16. 00 and 24.00, P ＞0.05 ). MTT assay indicated that cisplatin significantly inhibited HepG2 cells proliferation in a dose-dependent manner. Annexin V-FITC/PI assay showed that HepG2 cells apoptosis rates were (0.9 ± 0.2 ) %, ( 4. 2 ± 0.3 ) %, ( 9.8 ± 4. 3 ) %,(23.0 ± 6.0)%, respectively. Cisplatin significantly induced HepG2 cells apoptosis in a dose-dependent manner( F = 27.89, P ＜ 0.01 ). The expression levels of hZNF23 mRNA in cisplatin groups [( 10.39 ±3.08) × 10-5, (24.10 ± 2.09) × 10-5, (6.90 ± 2.24) × 10-4] were significantly lower than that of the controlgroup[(94.80±1.80) ×10-5, F=6.027, P＜0.01]. Conclusions The expression level hZNF23 mRNA is related to Edmondson stage of HCC. The apoptosis effect of cisplatin on HepG2 cells may be associated with the upregulation of hZNF23.     

RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗影响

目的探讨RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗敏感性的影响。方法构建针对HepG2细胞survivin基因的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。将HepG2细胞接种于6孔板中,分为空白对照组（不加药物）、阴性对照组（每孔加pshRNA-survivin-NC为3.2μg）、低浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为0.8μg）、中浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为1.6μg）、高浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为3.2μg）,作用48 h后收集细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡指数;将HepG2细胞接种于96孔板中,分为3组：空白对照组（不加药物）、阴性对照组（每孔加pshRNA-survivin-NC为0.2μg）、实验组（每孔加pshR-NA-survivin-387为0.2μg）,四甲基偶氮唑蓝法检测各组细胞分别与顺铂（2.0 mg/L）作用24、36、48、60 h后的增殖水平。结果各浓度转染组细胞的凋亡指数明显高于空白对照组和阴性对照组（F=228.87,q=10.45～38.21,P〈0.01）,高浓度转染组细胞凋亡指数高于低浓度转染组（q=23.99,P〈0.01）。顺铂对实验组细胞的细胞抑制率在24、36、48、60 h时明显高于空白对照组和阴性对照组（F=235.88～910.86,q=28.04～52.28,P〈0.01）。结论 pshRNA-survivin-387转染能诱导肝癌细胞的凋亡,增强肝癌细胞对顺铂化疗的敏感性。     

天年饮干预亚急性衰老大鼠模型的性腺功能

背景随着机体衰老性腺功能逐渐降低,中国传统医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因. 目的观察中药天年饮对亚急性衰老大鼠血清睾酮含量、睾丸组织超氧化物歧化酶的活性及睾丸生精细胞凋亡的影响. 设计随机对照实验. 单位承德医学院人体解剖学教研室. 材料实验于2003-04/07在承德医学院基础医学研究所进行.选择成年雄性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只.模型组、用药组、对照组采用D-半乳糖连续腹腔注射200mg/(kg·d)制备亚急性衰老动物模型,1次/d,共40 d,模型组大鼠于造模成功后不再作任何处理.用药组大鼠于造模成功后每天用天年饮灌胃(天年饮由灸何首乌、怀牛膝、肉从蓉、茯苓、丹参、淫羊藿6味中药组成,经熬制后含生药1.5 g/mL),1次/d,共30 d;对照组大鼠在造模成功后每天灌胃同等剂量的生理盐水,时间同用药组大鼠.方法各组大鼠血清中睾酮的含量采用酶联免疫吸附方法检测,睾丸组织中超氧化物歧化酶的活性采用黄嘌呤氧化酶法检测,睾丸生精细胞的凋亡情况采用免疫组化法观察. 主要观察指标①各组大鼠血清中睾酮的含量.②睾丸组织中超氧化物歧化酶的活性.③睾丸生精细胞的凋亡情况. 结果40只大鼠均进入结果分析.①血清中睾酮的含量模型组大鼠血清睾酮含量低于正常组[(0.52±0.15)μg/L,(1.26±0.32)μg/L,(t=3.004,P＜0.05)],用药组高于模型组[(1.16±0.32)μg/L,(0.52±0.15)μg/L,(t=2.321,P＜0.05)].②睾丸组织超氧化物歧化酶的活性模型组明显低于正常组[(107.22±9.33)kNU/g,(147.73±11.9)kNU/g,(t=13.339,P＜0.01)],用药组明显高于模型组[(141.05±14.57)kNU/g,(107.22±9.33)kNU/g,(t=9.970,P＜0.01)].③生精细胞的凋亡情况模型组凋亡生精小管百分率、凋亡阳性细胞率均明显高于正常组[(53.95±2.02)%比(34.21±2.10)%,(8.67±0.80)%比(3.86±0.52)%,(x2=7.9,＜0.01,x25.01.P＜0.05)];用药组明显低于模型组[(35.33±2.18)%比(53.95±2.02)%,(4.68±0.74)%比(8.67±0.80)%,(x2=7.02,P＜0.01,x2=3.96,P＜0.05)]. 结论衰老模型睾丸生精细胞凋亡增多,经天年饮灌胃后可以使凋亡细胞阳性率明显下降,说明天年饮可以清除体内过多的氧自由基,减少凋亡发生,改善动物模型的生精功能.     

枸杞皂苷通过调控Suv39H1/JAK2/STAT3通路对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的　探究枸杞皂苷介导Suv39H1/JAK2/STAT3通路对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法　将人鼻咽癌CNE-2细胞株分为枸杞皂苷干预组（5,10,50 μmol/L枸杞皂苷）及对照组,采用CCK-8检测不同浓度枸杞皂苷作用0,24,48和72 h时CNE-2细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测枸杞皂苷干预48 h后CNE-2细胞凋亡率,Transwell小室实验检测CNE-2细胞侵袭能力,实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）与蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测组蛋白甲基化酶Suv39H1的表达水平;采用qRT-PCR和Western blot分别检测Suv39H1在鼻咽癌组织和癌旁组织,以及鼻咽癌细胞系（HONE1,C666-1,CNE-1和CNE-2）和人鼻咽癌上皮细胞（NP69）中的表达差异;构建Suv39H1过表达载体（pcDNA-Suv39H1）以及针对Suv39H1的小干扰RNA（Suv39H1 siRNA）,分别转染于CNE-2细胞,检测细胞增殖、侵袭和凋亡;将pcDNA-Suv39H1载体转染于50 μmol/L枸杞皂苷干预的细胞中,分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡。Western blot检测JAK2/STAT3通路相关蛋白p-JAK2和p-STAT3的表达。结果　与对照组相比,枸杞皂苷干预鼻咽癌CNE-2细胞呈剂量依赖性降低细胞增殖（F=12.030,P=0.002 5）和侵袭（F=4.807,P=0.031 5）,增加细胞凋亡率（F=5.232,P=0.026 1）,抑制Suv39H1蛋白表达（F=14.64,P=0.001 3）;与正常组织和NP69细胞相比,鼻咽癌组织和HONE1,C666-1,CNE-1,CNE-2细胞中Suv39H1表达水平显著升高（P<0.01）;转染pcDNA-Suv39H1组细胞增殖、侵袭率增强、凋亡率降低;转染Suv39H1 siRNA组细胞增殖、侵袭率降低,凋亡率升高,差异与对照组相比具有统计学意义（P<0.01） ;与50 μmol/L枸杞皂苷干预组相比,转染pcDNA-Suv39H1组细胞增殖、侵袭率增加、凋亡率降低,p-JAK2和p-STAT3蛋白表达升高（P<0.01）。结论　枸杞皂苷通过下调Suv39H1/JAK2/STAT3通路抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖、侵袭,促进凋亡。     

吗啡联合加巴喷丁对术后持续性痛大鼠脊髓小胶质细胞的影响

目的:观察鞘内注射吗啡联合加巴喷丁对皮肤/肌肉切口和牵拉(skin/muscle incision and retraction,SMIR)术后持续性痛大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响。方法:选择鞘内置管成功的雄性SD大鼠120只,随机分为5组(n=24):假手术组、术后持续性痛组、吗啡组、加巴喷丁组和吗啡联合加巴喷丁组。按Flatters法制作大鼠SMIR术后持续性痛模型;应用机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)评定大鼠的疼痛行为学;应用免疫荧光技术检测脊髓背角活化的小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)的表达。结果:与假手术组比较,术后持续性痛组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显下降(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显增加(P<0.05);与术后持续性痛组比较,吗啡组和加巴喷丁组的MWT和脊髓背角Iba-1的表达无明显变化;与术后持续性痛,吗啡组和加巴喷丁组比较,吗啡联合加巴喷丁组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显增加(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显减少(P<0.05)。结论:吗啡联合加巴喷丁对大鼠SMIR术后持续性痛有镇痛作用,可能与抑制脊髓背角小胶质细胞的活化有关。     

吲哚美辛诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

背量一些与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡相关的疾病均与炎症刺激有关.目的探讨用吲哚美辛诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞的凋亡.设计随机对照、单盲法的前瞻性研究.地点和对象实验在中南大学湘雅二院实验中心进行,胎儿标本来源于中南大学湘雅二院妇产科.干预加入终浓度分别为100,200,400,600 μmol/L的吲哚美辛作用24 h;600 μmol/L作用6,12,24后用透射电镜定性观察凋亡细胞,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析.主要观察指标凋亡RPE细胞形态和数量的变化.结果经200,400,600μmol/L吲哚美辛作用24 h后RPE细胞凋亡数为(2.7000±1.3375),(5.100 0±1.370 3),(6.800 0±1.686 5),与对照组(0.200 0±0.421 6)相比,差异有显著性意义(t值分别为4.624,9.062,12.206,P＜0.01),随着吲哚美辛浓度的增加,RPE细胞凋亡数逐渐增多;600 μmol/L吲哚美辛作用12,24 h后RPE细胞凋亡数为(4.400 0±0.8433),(6.400 0±1.2649),与对照组(0.200 0±0.4216)相比,差异有显著性意义(t值分别为8.617,13.274,P＜0.01).结论吲哚美辛能诱导体外培养的人胚胎RPE细胞的凋亡,并且RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多.     

鞘内注射维生素B_6对大鼠慢性神经痛的镇痛作用及对DRG神经元p-ERK表达的影响

目的:观察维生素B_6(VitB_6)对神经病理性疼痛大鼠机械痛敏、热痛敏及L4～L5背根神经节(DRG)磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)表达的影响.方法:选择6只正常SD大鼠作为对照组(control),另选择鞘内置管3天后无神经损伤症状的SD雄性大鼠54只,随机分为3组(n=18):假手术组(sham):只分离坐骨神经;CCI组:结扎坐骨神经;CCI+Vit B6组:坐骨神经结扎后鞘内注射VitB_610mg/kg/d,连续两周.各组术前2天和术后1、3、5、7、10、14天测定各组大鼠热缩足反射潜伏期(TWL)、机械缩足反射阈值(MWT).除control组外其余各组分别在术后3d、7d和14d处死大鼠,采用免疫组织化学法观察L4～5 DRG和p-ERK的表达.结果:与sham组比较,CCI组术后各天TWL、MWT明显降低(P＜0.01);与CCI组比较,CCI+VitB_6组术后3、5、7、10、14天TWL明显增高(3天P＜0.05,5、7、10、14天P＜0.01),而术后各天MWT无明显差别.术后3、7、14天,CCI组结扎侧L4,5背根节p-ERK阳性细胞率明显高于sham组(P＜0.01),CCI+Vit B_6组结扎侧L4,5背根节p-ERK阳性细胞率明显低于CCI组(P＜0.01).结论:背根神经节ERK活化参与神经病理性疼痛信号传递,鞘内注射Vit B_6抑制CCI大鼠热痛敏,其机制可能包括通过上游机制抑制ERK激活.     

脂多糖诱导大鼠主动脉内皮细胞表达血管性血友病因子裂解酶的研究

目的 从剂量-效应和时间-效应关系探讨脂多糖(LPS)对大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS-13)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用组织贴块法培养Wistar大鼠的RAECs,1周后按1∶3传代至第4～5代,将细胞分为空白对照组和0.01、0.1、1、5 μg/ml LPS刺激组,分别于12、24、48、72 h用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定内皮细胞ADAMTS-13 mRNA表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液内ADAMTS-13蛋白水平.结果 空白对照组有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达.随着LPS刺激浓度增加和刺激时间延长,ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达逐渐下降.与空白对照组(25.22±1.41)比较,0.01μg/ml LPS刺激48 h时ADAMTS-13 mRNA表达(18.78±0.86)即明显下降(P＜0.01);0.1μg/ml和1μg/ml LPS刺激24 h时ADAMTS-13 mRNA表达(23.43±0.63、22.41±0.76)即明显下降(P＜0.05和P＜0.01);5μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13 mRNA表达(20.01±2.47)即明显下降(P＜0.01).与空白对照组[(115.76±2.36)ng/ml]比较,0.01 μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13蛋白表达[(113.43±1.07)ng/ml]即明显下降(P＜0.05);至5 μg/ml LPS刺激72 h时ADAMTS-13蛋白表达[(7.63±2.64)ng/ml]降至最低(P＜0.01).结论 RAECs有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达;不同浓度LPS刺激内皮细胞不同时间后ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达降低,具有剂量依赖性和时间依赖性.     

脊髓G蛋白表达在代谢型谷氨酸5受体参与吗啡耐受形成中的作用

目的:研究鞘内注射代谢型谷氨酸5受体(metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)反义寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)时大鼠吗啡耐受发生情况及其对脊髓内G蛋白各亚型表达的影响。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为6组:对照组(S组,n=14),反义链组(ANT组,n=6),错义链组(MIS组,n=6),吗啡耐受组(M组,n=6),反义链吗啡合用组(AM组,n=8)和错义链吗啡合用组(MM组,n=8)。采用鞘内给药方式注射寡聚核苷酸、吗啡和生理盐水。以5μl含30 nM的寡聚核苷酸(ANT组,MIS组,AM组和MM组)或0.9%生理盐水(S组和M组)每日给药2次,连续5天。于第6天取6只S组及ANT组和MIS组大鼠L4/5脊髓行real-time PCR,观察其mGluR5的mRNA表达。其余大鼠于第6天起连续3天每日给吗啡2次,每次15μg,S组以5μl0.9%生理盐水代替。给药后以热板试验测定其热痛阈,以缩爪阈值作为机械痛阈指标,并计算最大效应分数(maximum percent effect,MPE)进行比较。采用免疫印迹(western blot)方法检测并比较各组L4/5脊髓中G蛋白各亚型(Gαi,Gαo,Gαq和Gβ)的表达。结果:ANT组中mGluR5含量比S组下降48.2%(P<0.05),MIS组无此效果。M组和MM组大鼠MPE%在第8天与S组比较无统计学差异(P>0.05),AM组大鼠MPE%在第8天仍高于S组,有统计学意义(P<0.05)。AM组大鼠MPE%在第7~8天即显著高于M组(P<0.05)。第9天M组和MM组大鼠Gαi,Gαo,Gαq和Gβ的蛋白表达量显著高于S组(P<0.05)。而AM组大鼠G蛋白各亚型表达量均与S组无显著性差异(P>0.05),与M组相比显著下调(P<0.05)。结论:大鼠吗啡耐受发生时,大鼠腰段脊髓G蛋白各亚型表达均明显升高。鞘内注射mGluR5反义寡聚脱氧核苷酸能显著抑制大鼠吗啡耐受的发生并抑制G蛋白各亚型的表达升高。     

白细胞介素-10和肿瘤坏死因子-α与高血压肾损害的相关性研究

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)在高血压肾损害患者中的变化及其相关性.方法 将73例原发性高血压患者(原发性高血压组)根据其尿蛋白排泄率不同又分为2个亚组:单纯高血压组37例,高血压肾损害组36例;采用放射免疫法检测血清TNF-α、IL-10浓度.同期选择30名健康体检者作为正常对照组.结果 原发性高血压组TNF-α高于正常对照组[(2.91±0.94)μg/L与(0.98±0.35)μg/L,P＜0.01],其中高血压肾损害组TNF-α高于单纯高血压组[(3.75±0.88)μg/L与(1.87±0.58)μg/L,P＜0.01].原发性高血压组IL-10低于正常对照组[(19.2±5.8)μg/L与(28.6±5.7)μg/L,P＜0.01],其中高血压肾损害组IL-10又低于单纯高血压组[(15.4±4.3)μg/L与(22.5±5.9)μg/L,P＜0.01].原发性高血压组TNF-α、IL-10与尿蛋白排泄率有相关性(r=0.703,P＜0.001 ;r=-0.613,P＜0.001),而与血压水平无相关性.结论 高血压肾损害患者TNF-α升高,IL-10水平降低,细胞因子系统的失衡可能参与了高血压肾损害的进展.

Abstract：

Objective To investigate the changes of the serum levels of necrosis alpha (TNF-o)and interleukin 10( IL-10 )in patients with hypertensive renal damage,and to study the correlation of TNF-α and IL-10 with the hypertensive renal damage. Methods Seventy three patients with primary hypertension were divided into two groups according to their urinary albumin excretion rate(UAER): simple hypertensive group( n = 37 ),hypertensive renal damage group(n =36). TNF-α and IL-10 were measured using radioimmune assay. Thirty normotensive healthy persons were selected as normotensive control group. Results TNF-α were significantly higher and IL-10 significantly lower in patients with essential hypertension than those in normotensive control group(TNF-α: [2.91 ±0.94]μg/L vs [0.98 ±0.35]μg/L,P＜0. 05;IL-10:[ 19.2 ±5.8]μg/L vs [28.6±5. 7] μg/L,P ＜0. 01 ) ,and in patients with hypertension,those with renal damage had higher TNF-α and lower IL-10 than those without( TNF-α: [ 3.75 ± 0. 88 ] μg/L vs [ 1.87 ± 0. 58 ] μg/L, P ＜ 0. 01; IL-10: [ 15. 4 ± 4. 3 ]μg/L vs [ 22. 5 ± 5.9 ] μg/L, P ＜ 0. 01 ), with statistically significant difference between groups ( P ＜ 0. 01 ).TN F-α and IL- 10 were found to have correlations with UAER ( r = 0. 703, P ＜ 0. 001; r = - 0. 613, P ＜ 0. 001 ),but no correlation with the level of blood pressure. Conclusion TNF-α increased and IL-10 decreased significantly in patients with hypertensive renal damage, which indicates that the imbalanced cytokine network may play a role in the pathological mechanisms of hypertensive renal damage.