Persephin基因转染对缺氧诱导的神经干细胞凋亡的影响

目的:探讨重组腺病毒介导Persephin基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法:体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数,显微镜观察凋亡小体;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。结果:转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞成功表达Persephin蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡指数为(25.54±4.30)%,而转染pAdPersephin后的细胞凋亡指数显著减少至(10.04±1.32)%(P<0.01),而转染pAdCMVPersephin Persephin反义寡核脱氧核酸细胞凋亡指数为(24.05±3.05)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的：建立N-甲基-N亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea,MNU）损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化.方法：腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化.结果：TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显.核增殖抗原（PCNA）及细胞周期素CyclinD1的表达明显增高.与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白（nestin） RT-PCR显示胰岛素样生长因子（IGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF）mRNA的表达均升高.结论：在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性.而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖.     

靶向caspase-8小发夹RNA减轻去血清/缺氧诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡

 目的：研究caspase-8小发夹RNA（Cap8 shRNA）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）凋亡的调控作用。方法：构建2个靶向人caspase-8基因的穿梭质粒pAd-Cap8 shRNA,并鉴定可有效抑制人HEK293细胞中caspase-8表达的pAd-Cap8 shRNA质粒。构建表达Cap8 shRNA的重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装、扩增重组腺病毒rAd-Cap8 shRNA。检测rAd-Cap8 shRNA感染的hMSCs中caspase-8 mRNA和蛋白表达。利用anne-xin V/PI双染色法和caspase-8活性检测分析去血清/缺氧诱导的hMSCs凋亡变化,利用荧光定量PCR检测hMSCs中VEGF、肝细胞生长因子1（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、Bcl-2和Bcl-xL mRNA表达。结果：通过定量PCR筛选到可有效抑制caspase-8表达的pAd-Cap8 shRNA质粒。成功构建Cap8 shRNA的重组腺病毒质粒,并包装、扩增重组腺病毒rAd-Cap8 shRNA。荧光定量PCR和Western blotting结果证实rAd-Cap8 shRNA可有效抑制hMSCs中caspase-8表达。rAd-Cap8 shRNA能有效抑制去血清/缺氧诱导的hMSCs凋亡,降低caspase-8活性,增强hMSCs中HGF、IGF-1和Bcl-2表达。结论：Caspase-8 shRNA可以抑制去血清/缺氧诱导的hMSCs凋亡。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的:建立N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N nitrosourea,MNU)损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化。方法:腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化。结果:TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显。核增殖抗原(PCNA)及细胞周期素CyclinD_1的表达明显增高。与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白(nestin);RT-PCR显示胰岛素样生长因子(IGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)mRNA的表达均升高。结论:在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性。而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖。     

bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法：从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞，进行原代培养，分为bFGF组、EGF组、bFGF＋EGF组及对照组：培养过程中观察干细胞的生长，培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞，培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果：取材细胞大部分为nestin免疫阳性细胞；各实验组均可促进培养细胞的生长和分 化。免疫组化中，EGF使神经干细胞增殖成团，增加GFAP的表达（P＜0．01）；bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P＜0．01）；两种因子联合应用，神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P＜0．01）。结论：EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长，在分化方面，EGF倾向于诱导干细胞增并向着胶质细胞分化，bFGF则诱导干细胞分 成更多的神经元。     

P>胰岛素样生长因子-1抑制β淀粉样蛋白25～35诱导的神经干细胞凋亡/P>

目的 观察β-淀粉样蛋白(Aβ)对神经干细胞(NSCs)增殖和凋亡的影响,探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对Aβ介导的NSCs毒性作用的保护机制.方法 从E14 SD大鼠大脑中分离神经干细胞,分别用Aβ、IGF-1和Aβ加IGF-1处理,锥虫蓝(trypan blue)染色确定细胞死亡数量和细胞死亡率,BrdU标记并分析细胞增殖能力,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和新生细胞,TUNEL技术检测凋亡细胞.结果 IGF-1处理时细胞死亡率低下,有大量BrdU阳性细胞生成,但无TUNEL阳性细胞.Aβ处理组细胞死亡率在6～48 h快速上升,并形成大量TUNEL阳性细胞.而IGF-1加Aβ处理时,细胞死亡率较Aβ组显著下降.TUNEL阳性细胞显著减少.结论 Aβ促进神经干细胞死亡和凋亡;而IGF-1促进神经干细胞增殖并抑制由Aβ诱导的神经干细胞凋亡.     

腺病毒介导noggin基因修饰神经干细胞

目的:以重组腺病毒介导的noggin基因修饰小鼠海马源性神经干细胞,为基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供依据。方法:以重组腺病毒介导的noggin基因转染体外培养的神经干细胞,MTT法检测转染前、后神经干细胞的生长活性,应用免疫细胞化学及Western blot检测转染后Noggin蛋白在神经干细胞中的表达及noggin基因对神经干细胞定向分化的影响。结果:重组腺病毒pAdEasy-1-noggin转染神经干细胞后,神经干细胞中Noggin蛋白表达持续增加;转染后的NSCs在含血清的培养液中能定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并且其分化为神经元的数量明显增加。结论:重组腺病毒介导的noggin基因在细胞中可持续稳定表达,noggin基因能够促进神经干细胞定向分化为神经元,抑制其向星形胶质细胞方向分化,为下一步进行神经干细胞体内移植治疗提供了实验依据。     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的：构建人胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌型真核表达载体，并检测表达产物的生物活性。 方法：用RT-PCR法从人肝细胞克隆IGF-1基因，并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体，用脂质体法转染CHO细胞，将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞，用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况。 结果：成功扩增210 bp的IGF-1基因，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blotting检测具有7.7 kD特异性条带。骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加。 结论：成功构建分泌型IGF-1真核表达载体，其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用。     

携有胰岛素样生长因子1重组腺病毒对链脲佐菌素诱导胰岛β细胞损害的保护性研究

目的构建含有鼠胰岛素样生长因子-1(rIGF-1)重组腺病毒,研究rIGF-1在链脲佐菌素(STZ)诱导胰岛β细胞损害中的作用。方法构建重组腺病毒并感染RINm5F细胞,ELISA、Western blotting检测rIGF-1蛋白表达;STZ诱导细胞破坏,检测培养上清中NO水平,胰岛素释放试验进行功能测定,流式细胞检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率。结果成功构建含有rIGF-1基因重组腺病毒,病毒滴度为4.0×108pfu/ml,rIGF-1在细胞内外有效表达,并具有抑制STZ诱导胰岛β细胞凋亡和NO产生、保护细胞胰岛素分泌和促进细胞增殖的活性。结论胰岛β细胞局部表达IGF-1能够保护细胞功能,抑制NO产生,使胰岛β细胞免受诱导凋亡因子的损害,提高细胞存活率。STZ诱导胰岛β细胞凋亡可能与NO介导有关。     

胰岛素样生长因子1基因转染胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞移植治疗心肌梗死

目的:探讨经逆转录病毒载体介导的胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因转染胚胎干细胞(ESC)诱导分化的心肌细胞IGF-1的表达及移植于大鼠慢性心梗模型后对心功能的影响.方法:建立大鼠心梗模型后将心梗大鼠随机分为3组,分别注射移植转染心肌细胞(心肌细胞组)、转染IGF-1基因(IGF-1基因组)和DMEM培养基(DMEM组).取心标本作H-E染色及免疫组织化学检测,并计数血管密度.结果:IGF-1基因转染的心肌细胞表达IGF-1增高,与对照组比较差异有统计学意义;免疫组织化学检测显示,移植细胞在移植区存活;H-E染色血管计数显示转染心肌细胞组有更多的新生血管形成.结论:IGF-1基因转染心肌细胞后表达分泌IGF-1增加,可促进梗死区新生血管形成,有利于移植细胞的存活,能更好地改善心功能.     

神经干细胞过表达Hsp75降低Aβ介导的神经毒性

 目的: 应用腺病毒为载体在体外过表达热休克蛋白75(Hsp75),研究Hsp75蛋白过表达对神经干细胞在Aβ诱导神经毒性中的作用,并初步探讨其作用机制。方法: 体外培养小鼠神经干细胞C17.2,实验分为对照组、Aβ处理组、腺病毒阴性感染组和腺病毒Hsp75过表达感染组。使用荧光显微镜观察腺病毒的感染情况并进行细胞免疫鉴定;倒置相差显微镜观察各组神经干细胞的形态;MTT法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Hsp75和活化型caspase-3蛋白水平。结果: 荧光显微镜观察和Western blot检测表明腺病毒成功感染神经干细胞并高效表达Hsp75蛋白。此外,腺病毒感染不会导致细胞形态改变及细胞分化,同时也不会影响细胞活力。与对照组比较,Aβ处理组及腺病毒阴性感染组细胞存活率显著降低(P < 0.05),细胞凋亡率及活化型caspase-3蛋白水平显著增高(P < 0.05);然而,Hsp75过表达能显著提高神经干细胞的存活率,减少细胞凋亡和降低活化型caspase-3蛋白水平(P < 0.05)。结论: Hsp75过表达对Aβ诱导损伤的C17.2细胞具有明显保护作用,其机制可能是与抑制caspase-3途径依赖的细胞凋亡有关。     

Effect of transplantation of c17.2 cells transfected with interleukin-10 gene on intracerebral immune response in rat model of Parkinson's disease

Currently, regulation of immune response after grafting has become a hot topic in Parkinson's disease (PD) transplantation research. Interleukin-10 (IL-10) is an important regulator of immune system. Presently, we transplanted c17.2 neural stem cells transfected with pcDNA3.1-Hygro-IL-10 vector (IL-10-c17.2 cells) or Mock-c17.2 cells (c17.2 cells transfected with pcDNA3.1-Hygro vector) into the brains of 6-hydroxydopamine-lesioned PD model rats. From days 10 to 60 after grafting, double immunohistochemistry showed that IL-10 expression was detected in IL-10-c17.2 cells in vivo. Further immunohistochemistry analyses revealed that intracerebral cellular (ED1 and CD8) and humoral (C3 and IgM) immune responses were down-regulated in the rats treated with IL-10-c17.2 cells compared with controls treated with Mock-c17.2 cells. The reduction in ED1 immunostaining in the rats treated with IL-10-c17.2 cells remained significant until day 60 after transplantation. Our results suggest the potential application value of IL-10 in the transplantation treatment of PD.     

提高腺病毒表达载体扩增效率的研究

目的探讨在体外扩增重组腺病毒表达载体的有效方法。方法用含10%胎牛血清RPMI1640培养液常规培养人胚肾293细胞,当细胞生长至70%～80%汇合时,加入含有报告基因LacZ的重组5型腺病毒载体(Ad5CMVLacZ)共同培养36～38h。用X-gal组织化学方法检测Ad5CMVLacZ转染和表达的程度。结果293细胞生长至70%～80%汇合时,分裂增殖旺盛,形态为梭形、多角形,有明显分裂相,为指数生长期细胞。加入Ad5CMVLacZ8h后,293细胞开始出现肿胀,细胞间联系疏松,36～48h后细胞变成圆形、球形,对光折射增强,并聚集成葡萄串状。在此时间段作X-gal组化反应显示,约90%的293细胞被转染和表达产物。结论用上述方法可提高体外扩增腺病毒载体的效率,只要把握好病毒转染的时机和收获被转染293细胞的时机,就有可能制备出高滴度的病毒液,从而满足基因治疗神经退行性疾病的需要。     

5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析

 目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析。方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响。结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+ T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响。结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性。     

携带小鼠IGF-1基因的慢病毒载体构建及其在神经干细胞中的表达

目的:构建含有小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的慢病毒载体,鉴定其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法:采用RT-PCR方法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增IGF-1基因,克隆入pcDNA3.1质粒,构建慢病毒载体pXZ9-IGF-1。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,获得病毒上清。分离培养神经干细胞,Nestin免疫荧光化学鉴定。慢病毒感染神经干细胞,显微镜下观察GFP表达情况,通过RT-PCR及ELISA试剂盒分别从mRNA和蛋白水平检测IGF-1的表达。结果:通过RT-PCR法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增出IGF-1基因并克隆入pcDNA3.1载体,经亚克隆成功构建慢病毒质粒pXZ9-IGF-1。质粒经脂质体转染293FT细胞获高滴度慢病毒颗粒,体外高效感染神经干细胞。神经干细胞经感染后,IGF-1基因mRNA和培养基中蛋白水平均高表达。结论:成功构建含小鼠IGF-1基因的慢病毒载体pXZ9-IGF-1,并在神经干细胞内获得表达。     

X盒结合蛋白1转染神经干细胞移植帕金森大鼠黑质中相关递质及核蛋白的表达

背景：既往研究发现,X盒结合蛋白1基因可以转染至神经干细胞中并稳定过表达X盒结合蛋白1,转染后的神经干细胞移植对脑梗死的治疗作用优于普通神经干细胞。 目的：通过测定转染后神经干细胞移植对帕金森大鼠模型黑质内单胺类递质和α-突触核蛋白水平的影响,研究转染后的神经干细胞移植对帕金森病的治疗作用。 方法：将27只帕金森病大鼠随机数字表法均分为3组。对照组侧脑室内移植PBS,神经干细胞组移植空白神经干细胞悬液,转染组移植X盒结合蛋白1基因修饰神经干细胞悬液。分别于移植后7,14,21,28 d对各组大鼠进行诱导旋转实验观察神经功能; Western blot检测α-突触核蛋白水平;黑质切片后免疫组化染色测酪氨酸羟化酶(+)神经细胞。 结果与结论：转染组大鼠黑质内α-突触核蛋白表达量降低,酪氨酸羟化酶(+)神经细胞数高于神经干细胞组和对照组,且大鼠旋转实验中旋转行为改善。表明在帕金森病中,X盒结合蛋白1转染的神经干细胞分化为多巴胺能神经元的分化率高,转染后可降低α-突触核蛋白的聚集,从而改善帕金森症状起到治疗目的。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染小鼠胚胎干细胞及其无血清神经细胞诱导

目的构建表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞(MES)克隆，观察基因转染对MES细胞增殖和无血清诱导为nestin阳性神经前体细胞(NPCs)的影响。方法原代分离小鼠胚胎成纤维细胞并经丝裂霉素-C处理作为饲养层细胞。质粒的转化、抽提、纯化。电穿孔法基因转染，MES细胞克隆的NBT／BCIP染色，NPCs的nestin免疫组织化学染色。结果EGFP基因转染后可得到表达绿色荧光蛋白的MES细胞克隆，采用N2或ITSF无血清条件培养基可将其定向诱导为nestin阳性的并能发绿色荧光的NPCs。基因转染后的MES细胞增殖、神经前体细胞诱导率和未转染组相比均无明显下降，但NPCs绿色荧光的表达较诱导前明显下降。结论基因转染对ES细胞的增殖和神经分化无明显影响。     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。 目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。 方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。 结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×10⁹ pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

HBsAg腺病毒疫苗载体的构建及293细胞中的包装表达

目的：HBsAg与腺病毒骨架载体质粒构建，在293细胞中包装表达重组腺病毒颗粒，建立HBsAg腺病霉疫苗。方法：以pEcob-6为模板，PCR扩增目的基因HBsAg，腺病毒穿梭载体PAd-track-cmv与HBsAg重组为PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒；腺病毒骨架载体质粒PAd-Easy-1再与PAd-track-emv-HBs同源重组为PAd-Easy-1-HBs质粒；用脂质体介导的转染法将PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞，包装成重组腺病毒颗粒。酶联免疫吸附法测定细胞上清中HBsAg的表达，建立HBsAg腺病毒疫苗。结果：PAd-Easy-1-HBs转染到293细胞中，合成荧光蛋白，荧光显微镜下细胞发绿色荧光。再次感染293细胞，90％以上的细胞脱落。细胞上清液中也测定出有HBsAg的表达。结论：HBsAg腺病毒疫苗载体构建成功，并能在293细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒，为免疫动物实验提供条件。