乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

【目的】构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。【方法】根据乳酸菌L.lactis MG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。【结果】琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。【结论】乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒tat基因重组慢病毒表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因重组慢病毒表达载体。方法将pCDH-GFP和pCDHRFP载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切制备线性化载体;通过设计引物及PCR扩增,获得5′端与3′端分别与15nt线性化载体3′端与5′端互补的tat基因片段;tat基因片段和线性化载体经纯化后,进行重组反应;将重组产物转化感受态细胞DH5α,通过菌落PCR、质粒双酶切、序列测定等方法鉴定重组克隆。结果菌落PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在约354bp位置出现预期的条带;EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒经琼脂糖凝胶电泳,在约7544bp和354bp位置上出现预期条带;通过测序,重组质粒中插入的tat基因序列与GenBank基因库中的HIV-1tat基因序列同源。结论采用本研究方法能成功构建HIV-1tat基因重组慢病毒表达载体。     

人生物素基因的原核表达及纯化

目的构建生物素原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白,为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从胃癌细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出生物素基因;用BamHⅠ和HindⅢ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切,构建pET32．生物素重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对,确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达,Western-Blotting鉴定。用Ni2＋金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果通过RT-PCR。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增的生物素DNA片段与预期大小一致。经双酶切及DNA测序鉴定,生物素DNA定向插入了pET32质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western．Blotting鉴定。所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白。结论成功构建了生物素基因原核表达载体,表达和纯化了生物素融合蛋白。     

人钙调磷酸酶-B真核表达质粒的构建

目的 为研究钙振荡现象,构建人钙调磷酸酶-B(CNB)基因的真核表达质粒.方法 采用RT-PCR技术,从MCF-7细胞中扩增出人CNB基因序列;利用分子克隆技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.0中,并进行酶切鉴定和DNA测序.结果 琼脂糖凝胶电泳分析显示RT-PCR产物为预期分子量大小,酶切鉴定图谱正确,DNA测序结果经核实完全符合.结论 成功构建人CNB基因的真核表达质粒,为进一步研究钙振荡现象打下了基础.     

人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA的构建及鉴定

目的:构建人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA.方法:根据CyPA基因设计引物,从人肺痛组织eDNA中扩增目的基因.pET30α(+)质粒、目的基因DNA经Nde I酶、Xho I酶双酶切,用DNA快速连接试剂盒连接得重组子pET30α(+)-CyPA.将重组子转化DH5α,经卡那霉素琼脂糖平板筛选,挑选阳性克隆进行PCR扩增并测序.结果与结论:快速PCR能从阳性克隆中扩增出目的DNA.将重组质粒测序,由起始密码ATG到终止密码TAG止,扩增得到的目的基因片段具有完整的阅读框;与人CyPA基因cDNA序列进行比较,同源性达到99.8%.重组质粒pET30α(+)-CyPA构建成功.     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3．1／CGRP的构建

目的构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因（rCGRP）的重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）／rCGRP。方法应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA，RT—PCR扩增rCGRPeDNA（PCR引物上加上双酶切位点），产物通过Hindm和BamHI酶切、纯化、连接，将目的基因插入真核表达质粒载体peDNA3．1（＋），再将重组质粒转化感受态细菌，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆。结果（1）RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合；（2）重组克隆鉴定①PCR鉴定。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPeDNA大小相吻合；②酶切鉴定，抽提质粒经双酶切，酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带，分别和pcDNA3．1（＋）和rCGRPcD-NA大小相吻合；③DNA测序，测序结果经BLAST分析，与rCGRP基因编码区全长序列完全一致。结论（1）大鼠脑组织中有rCGRP的表达；（2）通过RT—PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）／rCGRP。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

Rho鸟苷酸解离抑制因子-2过表达载体的构建与慢病毒包装

目的:为研究β2肾上腺素能受体减敏的机制,构建Rho鸟苷酸解离抑制因子-2(Rho GDI2)过表达慢病毒载体.方法:GenBank搜索Rho-GDI2基因序列(Gene ID:14570,序列号:NM_008113),设计PCR引物扩增目的基因,双酶切后凝胶电泳回收酶切产物.质粒双酶切获得线性载体,将目的基因和线性载体进行琼脂糖凝胶电泳分离回收目的条带.再行目的基因和载体的连接,连接产物转化感受态细胞;菌液PCR阳性克隆鉴定并抽提质粒并测序.最后293T细胞内包装慢病毒质粒并测其病毒活力与滴度.结果:通过DNAStar SeqMan软件对测序结果进行分析,测序结果与目标序列一致.病毒质粒转染细胞效率较高,病毒活力较高,通过标准曲线测得病毒滴度pLenti-GDI慢病毒液:1.22×108 vp/mL.结论:成功构建了Rho GDI2过表达慢病毒载体.     

人珠蛋白MAR序列的克隆与表达载体pCAT-MAR的构建

目的克隆人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment regions,MAR),构建包含MAR及报告基因CAT的哺乳动物载体pCAT-MAR。方法酚/氯仿抽提、乙醇沉淀提取人基因组DNA,根据GenBank报道的序列设计引物PCR扩增人β-MAR,琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序,软件分析其序列特征。限制酶酶切,连接至pCAT3-control载体上构建pCAT-MAR载体。结果琼脂糖凝胶电泳PCR扩增出770bp条带,序列和报道的序列相似性为99.9%,克隆的DNA片段具备典型的MAR特征。酶切及琼脂糖凝胶电泳证明所构建的pCAT-MAR载体正确。结论PCR克隆了人-β珠蛋白MAR序列,成功构建了包含MAR的表达载体pCAT-MAR。     

赖型钩端螺旋体601株OmpL1蛋白的表达、纯化及功能分析

目的对钩端螺旋体黄疸出血群赖株ompL1基因进行克隆、表达及产物的纯化。方法从我国钩端螺旋体黄疸出血群赖株基因组中扩增全长ompL1基因片段,克隆至pGEM-T载体,回收经EcoRⅠ HindⅢ双酶切产物,将其与表达载体pET32a连接,通过酶切图谱和序列分析法筛选出重组质粒。将含重组质粒的宿主菌诱导表达后,提取全菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果获得pET9L重组质粒,经诱导表达后得到分子量为31000的重组蛋白。测序得到的ompL1基因核苷酸序列与已发表ompL1基因序列(GenbankI61405)同源性为99.8%,所推导的氨基酸序列(GenbankLA3138)的同源性达100%。结论成功构建了ompL1基因的原核表达系统,为进一步制备以OmpL1为检测靶抗原的免疫层析试剂盒奠定基础。     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.     

HSA-TP5融合基因表达载体的构建及其真核表达

目的：构建人血清白蛋白（HSA）-胸腺五肽（TP5）融合蛋白表达载体,并在毕赤酵母中表达,阐明其生物学活性。方法：利用基因重组技术构建HSA-TP5融合基因,并转染至毕赤酵母中从而构建其真核表达体系,通过琼脂糖凝胶电泳分离及试剂盒纯化获得PPICZαC-HSA-TP5真核重组表达质粒;采用两步发酵法对HSA-TP5基因工程菌进行高密度发酵,对发酵液上清蛋白沉淀浓缩,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、阳离子交换层析及疏水层析等方法分离纯化蛋白;采用MTT法检测该融合蛋白促淋巴细胞增殖活性。结果：PCR法获得HSA目的基因片段长度为1 845 bp。酶切鉴定融合质粒HSA-TP5-pPICZαC得到片段长度为707 bp。测序分析,目的基因HSA和TP5序列与GenBank公布的基因序列完全一致,并正向连接融合。PCR法鉴定PPICZαC-HSA-TP5真核重组质粒与酵母基因组DNA整合,与对照组比较,转化组出现基因片段长度为1 860 bp。SDS-PAGE分析,在甲醇诱导后72 h内,随着诱导时间延长,HSA-TP5融合蛋白表达量逐步升高。利用阳离子交换层析及AKTA多功能蛋白纯化系统纯化得到HSA-TP5融合蛋白。MTT法检测,HSA-TP5融合蛋白与TP5蛋白具有一致的促淋巴细胞增殖活性。结论：通过构建HSA-TP5毕赤酵母真核表达体系可获得HSA-TP5融合蛋白并具有生物学活性。     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建

目的：获得人血小板生成素全长cDNA克隆，并构建重组表达载体pQE30-TPO。方法：利用RTPCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，经菌落PCR鉴定后，DNA序列分析重组质粒pMD18－T－TPO。构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。结果：构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO，序列分析表明，获得的TPO cDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。结论：成功构建了重组表达载体pQE30-TPO，为TPO的进一步研究奠定了基础。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。