新型细胞转染素——N4-精胺胆固醇羰酰氨的合成

目的 合成新型阳离子脂质体—细胞转染素N^4-精氨胆固醇羰酰氨，作为基因载体，用于肺部疾病的基因治疗。方法 用胆固醇羰酰氯为原料，与节氧羰酰基保护的精氨选择性缩合，去保护，柱层析分离纯化。结果 以25．46％收率获得目标化合物，由波谱分析证实其结构。结论 建立选择性缩合和分离纯化方法，获得高纯度目标化合物，为基因转染和基因治疗打下基础。     

阳离子脂质体的研究进展

基因治疗面临的首要技术问题是基因药物的载体,目前用于基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点,但在体内具有较大的潜在危险,限制了它在临床基因治疗上的应用.非病毒载体中最具典型的是阳离子脂质体(cationic liposomes)载体,它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点,近年来备受研究者的重视,至今已有数10种阳离子脂质体被研制合成出来.现就其进展综述如下.     

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展

目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点。     

阳离子脂质体的转染机制和影响转染效率的因素

阳离子脂质体以其制备简单、无毒、无免疫原性、可生物降解等优点,成为了近年来基因转移中的常规载体。简述了阳离子脂质体的结构及特性、转染机制、影响转染效率的因素、应用及存在的问题。     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 岬腟IRNA表达载体Genesil-HIF1a与阳离子脂质体复合物对EPG-2细胞增值及其对HIFl a表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1a),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3ug:15ul配比的pGenesil-SIRNAc与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,Q418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃,5%CO2,5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1a mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果 培养36小时的阳性对照组Hif-1a m RNA表达明显减低(P＜0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P＜0.05);结论 3ug:15ul计量配比组pGenesil-hif-1a与阳离子脂质体复合物可有效转染 Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1a的表达,并抑制其增殖.     

阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

Cationic Liposome-mediated bcl-xl Gene Transfection into Human Keratocytes

The efficiency and safe range of Lipofectamine^TM 2000 (LF2000)/bel-xl applied in human keratocytes, the optimal ratio of LF2000/bcl-xl and the bcl-xl gene expression in human keratocytes were investiaged. By using trypan-blue staining, the effects of LF2000 and bcl-xl on the survival rate of the cultured human keratocytes were measured respectively. By using semi-quantitative RTPCR, the efficiency and the expression of LF2000-mediated bcl-xl transfection into keratocytes were examined. The results showed that the survival rate of human keratocytes had no signficant change in the presence of LF2000 (20μg/ml) or bcl-xl (10μg/ml) for 24 h. I.F2000 could effectively mediate the transfection of exogenous gene bcl-xl into human keratocytes. The best transfection efficiency could be obtained when the ratio of bcl-xl/LF2000 was 1:8. One day after transfection, the positive cells for bcl-xl could be detectable, and the positive rate reached the peak-on the posttransfection day 3 (48.3%), then gradually decreased. Fifteen days after transfection, there were few positive cells. It was suggested that LF2000 could effectively transfer the exogenous gene bcl-xl into human keratocytes without obvious toxicity during a concentration range. LF2000/bcl-xl may be likely to play an important role in gene therapy of human keratocytes.     

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV－TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV－TK基因的真核表达载体pCR3-5K,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中，筛选出阳性克隆，给予不同浓度的ACV，观察不同时间对细胞的杀伤情况，并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高（P＜0．01），ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3-TK转移，进行胶质瘤HSV－TK／GCV基因治疗的研究，为胶质瘤的治疗提供一种新方法。     

脂质体包裹mA20及其突变体质粒转染对内毒素血症小鼠的治疗作用

目的研究脂质体包裹A20及其突变体mA20-ZnF4-7(mA20Δ)质粒对脂多糖(LPS)攻击所致内毒素血症小鼠的治疗作用。方法用LPS攻击小白鼠制备内毒素血症动物模型。随机分为:生理盐水对照组(NS组)、单纯内毒素组、空质粒组、脂质体包裹mA20质粒治疗组(L-mA20组)、脂质体包裹mA20Δ质粒治疗组(L-mA20Δ组)。以ELISA检测各组血浆TNF-α、IL-1β表达,并于12h时间点观察组织病理变化。结果(1)L-mA20组和L-mA20Δ组的TNF-α在各时间点表达(pg/mL)分别为:6h(304.696±6.087)(、304.985±6.291),12h(321.217±10.579)、(256.580±33.524),24h(307.594±11.181)(、280.348±11.698);与单纯内毒素组、空质粒组的TNF-α表达比较有显著性降低(P<0.05)。(2)L-mA20组和L-mA20Δ组的IL-1β在各时间点表达(pg/mL)分别为:6h(256.989±3.921)、(263.655±5.645),12h(205.724±4.827)、(154.690±1.380),24h(165.724±7.772)(、101.816±3.259);依时间有显著性下降趋势;与单纯内毒素组、空质粒组的IL-1β表达比较有显著性降低(P<0.05)。(3)病理观察结果显示:L-mA20组和L-mA20Δ组的肝、肺损伤均较单纯内毒素组、空质粒组轻;与NS相比,肝、肺损伤无明显差别。结论尾静脉注射被脂质体包裹mA20及其突变体mA20-ZnF4-7质粒对内毒素血症小鼠有相似的治疗作用,为临床应用结构更简单的A20蛋白提供了一定实验基础。     

磁性阳离子纳米脂质体的制备及其性能表征

目的 探讨磁性阳离子纳米脂质体的制备方法及其性能特征.方法 采用薄膜分散法制备磁性阳离子纳米脂质体,并且对其形貌、粒径、磁场响应性、细胞毒性进行表征.结果 薄膜分散法制备磁性阳离子纳米脂质体方法简单易行,制备的磁性阳离子纳米脂质体的形貌呈球形,平均粒径为98 nm;且具有超顺磁性,在水溶液中的磁场响应性能良好;MTT实验表明磁性阳离子纳米脂质体是毒性较小的基因转染载体.结论 薄膜分散法制备的磁性阳离子纳米脂质体粒径小、分布均匀、细胞毒性小,将可作为肝癌基因治疗一种理想的非病毒转染栽体.     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.