可溶性人TRAIL分子对Jurkat细胞的杀伤作用

目的　研究可溶性人TRAIL蛋白 (sTRAIL)对Jurkat细胞的生长抑制效应及凋亡诱导作用。方法　通过RT PCR扩增人TRAIL分子胞外区 4 1～ 2 81的密码子 ,利用大肠杆菌DH5α表达该可溶性片段 ,经纯化和复性后 ,诱导Jurkat细胞 ,通过显微镜、台盼蓝排斥试验、MTT法、流式细胞仪和DNA断裂实验检测细胞增殖和细胞凋亡。结果　sTRAIL蛋白纯度达 90 %以上。用 0 .5～ 10 .0 μg/ml的蛋白诱导Jurkat细胞 12h以上细胞的生长和增殖即被显著抑制 ,并且观察到凋亡峰及DNA的片段化等凋亡的特征性变化 ,细胞的生长抑制率与凋亡率也呈剂量依赖和时间依赖关系。结论　利用大肠杆菌制备的sTRAIL41 2 81蛋白对Jurkat细胞具有明显的增殖抑制效应和凋亡诱导作用。     

TNF相关凋亡诱导配体对肝癌细胞系生物学活性的影响

 目的：探讨新型凋亡分子TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人肝癌细胞系的作用及生物学活性的影响。 方法： 免疫细胞化学法检测HepG2细胞表面膜结合型TRAIL的表达，ELISA法检测HepG2细胞分泌型TRAIL的表达。MTT和TUNEL法分别进行细胞毒实验和凋亡的检测。HepG2细胞内端粒酶的活性由TRAP-PCR法检测，端粒酶催化亚单位hTERT的表达由流式细胞术进行检测。 结果： HepG2肝癌细胞系表面组成性表达TRAIL分子，并有适量的sTRAIL呈分泌表达。细胞毒实验显示TRAIL能够显著抑制肝癌细胞的生长，TUNEL检测结果显示TRAIL具有诱导肝癌细胞凋亡的效应。端粒酶的活性检测显示，TRAIL能够有效抑制肝癌细胞系内端粒酶的活性以及端粒酶催化亚单位的表达。 结论： TRAIL是一个有效的抑癌分子，能够通过诱导细胞凋亡、抑制端粒酶活性等途径控制肿瘤细胞的生长和进一步杀伤肿瘤细胞。     

脐带间充质干细胞运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白对B鄄淋巴瘤细胞的生长抑制作用

目的:探讨脐带间充质干细胞运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白的新型双重靶向系统对CD20+ BJAB 细胞的生长抑制作用。方法: 采用传统分子生物学技术构建pLenR scFvCD20:sTRAIL、pLenR ISZ-sTRAIL、pLenR scFvCD20 及pLenR copGFP 四种慢病毒表达载体,利用四质粒慢病毒包装系统于293T 细胞中包装慢病毒颗粒,并感染人脐带组织来源的MSCs(HUMSCs),使其稳定表达融合蛋白。于体外采用CCK8 细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白对CD20 阳性BJAB 细胞和Raji 细胞、CD20 阴性Jurkat 细胞以及正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的生长抑制作用。建立NOD/ SCID鼠BJAB 细胞皮下移植瘤模型,将MSC郾scFvCD20:sTRAIL 经尾静脉注射入小鼠体内,每3 d 测量瘤体积,根据肿瘤体积计算抑瘤率。结果:成功构建了慢病毒表达载体pLenR-scFvCD20:sTRAIL、pLenR-ISZ-sTRAIL、pLenR-scFvCD20 及pLenR copGFP,且经慢病毒感染可在HUMSCs 中稳定表达。体外实验显示,scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白可不同程度地提高对CD20 阳性BJAB和Raji 细胞的生长抑制作用,而对CD20 阴性Jurkat 细胞的生长抑制作用降低;而且不影响PBMCs 的生长。体内实验表明,MSC-scFvCD20:sTRAIL 可显著抑制BJAB 淋巴瘤的生长,初始治疗后第24 天,抑瘤率达65.2%,与MSC ISZ:sTRAIL 治疗组比较(抑瘤率为52.7%),具统计学差异(P<0.05)。结论:建立了HUMSCs 运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白的双重靶向治疗系统,HUMSCs 可向BJAB 淋巴瘤部位归巢并表达分泌scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白,后者在局部经scFvCD20 的二次导向发挥CD20 特异性抑瘤作用。为MSCs 作为肿瘤靶向治疗载体在临床中的应用提供了理论依据。     

IL-12依赖于TRAIL途径增强NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能

目的:探讨IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的相关机制。方法:纯化正常人NK细胞,分为加或不加IL-12两个刺激组,通过基因芯片筛选差异基因,并通过流式细胞术在单个细胞水平检测相关杀伤分子的表达。结果:基因芯片系统结果显示IL-12刺激组和未刺激组相比,17种基因具有显著性差异(fold change≥10),其中5种基因上调,12种基因下调。在IL-12的刺激作用下,TRAIL的表达在CD56+CD16+和CD56-CD16+NK细胞上显著增加。同时,Jurkat细胞亦高表达TRAIL受体TRAIL-R2(DR5)。TRAIL中和抗体RIK-2可以阻断IL-12诱导的NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能。结论:TRAIL是IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的主要途径之一。     

TLR7/8配体(R848)对人NK细胞杀伤功能的作用及其机制的探讨

目的研究R848对人自然杀伤细胞(NK)杀伤功能的作用及其机制。方法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)、纯化NK细胞,加或不加R848进行培养。分别在0、2、6、24、48h收集培养细胞,流式细胞术检测R848对NK细胞表面活化分子CD25和CD69表达的影响;检测R848活化的NK细胞杀伤靶细胞K562的作用、通过检测颗粒酶A、B、穿孔素、TRAIL和NK细胞与靶细胞共孵育后CD107a/b的表达,探讨R848促进NK细胞的杀伤功能机制。结果 R848活化的NK细胞在培养24h时CD69和CD25分子的表达百分率和平均荧光密度达到峰值,随后活化分子的表达有所下降;R848活化的NK细胞对靶细胞的杀伤功能明显增强,TRAIL在不同NK细胞亚群的表达显著增加(P0.05)。当NK细胞与K562共孵育后,R848活化的NK细胞表面CD107a/b的表达较未刺激条件明显增加。结论 R848可直接作用于NK细胞促进其杀伤功能,其作用机制与NK细胞活化后释放颗粒酶和穿孔素增加,并且TRAIL的表达增加有关。     

抗人DR5抗体mDRA- 6细胞毒作用机制分析

目的:探讨鼠抗人DR5单克隆抗体(mAb)mDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用及其机制。方法:以流式细胞术测定mAbmDRA-6对Jurkat细胞的细胞毒作用和细胞凋亡作用,以及caspase8、9的抑制剂对mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡的影响。在荧光显微镜下,观察mAbmDRA-6对Jurkat细胞形态的影响。以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中的DNA片段化。结果:mAbmDRA-6对Jurkat细胞具有显著的细胞毒作用,并呈剂量和时间依赖性。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。经mAbmDRA-6处理后,Jurkat细胞膜表面高表达丝氨酸磷脂,并可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。caspase8的抑制剂可明显抑制mAbmDRA-6诱导的Jurkat细胞凋亡,caspase9的抑制剂的影响很小。结论:mAbmDRA-6可通过死亡受体信号传导途径诱导Jurakt细胞凋亡,对Jurkat细胞产生细胞毒作用,其在以TRAIL/DR5系统进行的肿瘤治疗和探讨DR5功能结构域方面具有广阔的应用前景。     

一氧化氮与活化的小鼠腹腔巨噬细胞细胞毒作用关系的研究

本文选用Raji和K562两种细胞株作靶细胞,以LPS和IFN-γ作为巨噬细胞(MΦ)的激活剂,研究了一氧化氮(NO)在活化的小鼠腹腔巨噬细胞(PEMΦ)细胞毒中的作用以及靶细胞对MΦ合成NO的影响.结果表明,PEMΦ被激活后,合成NO量大为增加,并对Raji和K562两种靶细胞表现出很高的细胞毒效应;加入NO合酶抑制剂L-NMMA,PEMΦ对Raji的杀伤作用受到显著抑制,而对K562的细胞毒作用则不受影响.此外,在实验条件下,Raji细胞的存在可促进PEMΦ产生NO,而K562细胞则有削弱PEMΦ合成NO的倾向.     

白血病细胞纤溶活性及机制的研究

目的： 研究白血病细胞纤溶活性及其与尿激酶受体(uPAR)和膜联蛋白Ⅱ(annexinⅡ)表达的关系。方法: 用发色底物法测定NB4、SHI-1、K562、Jurkat、Raji细胞与纤溶酶原相互作用后白血病细胞的纤溶活性。用流式细胞术检测NB4、SHI-1、K562、Jurkat、Raji细胞表面uPAR和annexinⅡ的表达。以RT-PCR方法检测uPAR基因和annexinⅡ基因在NB4、SHI-1、K562、Jurkat、Raji细胞系中的表达。结果: SHI-1细胞和NB4细胞的纤溶活性明显高于Raji、K562和Jurkat细胞的纤溶活性。uPAR和annexinⅡ在NB4细胞的表达率分别为(13.15±1.61)%与(95.97±1.19)%，在SHI-1细胞的表达分别为(99.00±0.26)%与(90.35±2.15)%，在K562、Jurkat、Raji细胞的表达均低。NB4细胞annexinⅡ的基因表达较SHI-1细胞高，K562和Jurkat细胞中未检测到annexinⅡ的基因表达。NB4和SHI-1细胞uPAR基因表达高于Jurkat和K562细胞，Raji细胞中未检测到uPAR基因的表达。结论: NB4与SHI-1白血病细胞株存在高纤溶活性，与annexinⅡ和uPAR的表达增高相关，这可能是早幼粒细胞白血病与急性单核细胞白血病患者在临床上易发生出血及并发弥散性血管内凝血的一个重要原因。     

癌基因p21~(ras)、raf和细胞外信号调节蛋白激酶参与刺激Jurkat细胞产生TNF-β和IL-2

目的　明确p2 1ras 细胞外信号调节蛋白激酶 (theextracellularsignal regulatedproteinki nase,ERK)系列是否参与调节Jurkat细胞产生TNF β和IL 2。方法　用负向突变基因p2 1ras(ras17N或ras15A) ,raf 1(raf1～ 130 )及ERK1(erk1K71R)或活性结构p2 1ras(H ras6 1L)和raf(raf2 2W)转染细胞 ,以PMA PHA刺激细胞 ,ELISA法检测细胞因子。结果　PMA PHA刺激细胞产生较正常对照细胞约 2倍的TNF β和IL 2 (P <0 .0 0 1)。负向突变基因去除了PMA PHA增加细胞因子分泌的作用。活性突变基因本身不影响TNF β和IL 2产生 ,但明显增强细胞对PMA PHA的应答 (P <0 .0 5 )。结论　p2 1ras ERK系列在调节Jurkat细胞在PMA PHA刺激下产生TNF β和IL 2中起重要的作用。     

AGEs通过RAGE促进Jurkat细胞分泌肿瘤坏死因子-α

目的:探讨晚期糖化终产物(AGEs)与晚期糖化终产物受体(RAGE)结合对Jurkat细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响及相关信号分子的变化。方法:不同浓度AGEs作用于植物血球凝集素(PHA)预刺激的Jurkat细胞24小时,MTT检测AGEs对细胞生存率的影响,ELISA检测AGEs诱导Jurkat细胞分泌TNF-α;Western blot检测AGEs诱导Jurkat细胞表达RAGE和p38MAPK、JNK磷酸化水平。结果:AGEs作用于PHA预刺激Jurkat细胞24小时对细胞生存率无明显影响;AGEs促进Jurkat细胞表达RAGE,增加炎症因子TNF-α分泌,抗RAGE抗体明显抑制AGEs诱导的TNF-α分泌。AGEs可引起p38MAPK、JNK磷酸化,p38MAPK、JNK的抑制剂明显抑制AGEs诱导的TNF-α表达。结论:AGEs通过RAGE促进PHA预刺激的Jurkat细胞分泌炎症因子TNF-α,其机制与激活p38MAPK、JNK途径有关。     

TRAIL及其受体DR5与动脉粥样硬化关系的初步研究

目的探讨肿瘤坏死因子(INF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体DR5与动脉粥样硬化(AS)之间的关系。方法冠心病(CAD)组61例,正常对照组22例。应用酶联免疫吸附法测定血浆可溶性TRAIL(sTRAIL)和可溶性DR5(sDR5)水平。免疫组织化学测定冠状动脉TRAIL和DR5蛋白表达情况。结果CAD组血浆sTRAIL和sDR5水平均显著性升高(P<0.001,P<0.05)。3支血管病变组和双支血管病变组血浆sTRAIL和sDR5水平均分别显著高于单支血管病变组和正常对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。TRAIL和DR5主要表达于平滑肌细胞的胞质,TRAIL还可表达于AS中的巨噬细胞。AS组冠状动脉的TRAIL和DR5表达明显高于非AS组(P<0.01,P<0.05)。结论TRAIL及其受体DR5可能参与了AS的进展,其浓度越高,冠状动脉病变越重。     

Increased expression and release of functional tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) by T cells from lupus patients with active disease

Increased expression of TRAIL in membrane-bound and soluble form in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) has been previously reported. In this study, we characterized the upregulation of T-cell-associated and soluble TRAIL (sTRAIL) in vivo and the modulation of TRAIL expression and soluble protein release in vitro following T cell activation and IFNalpha exposure. The expression of membrane-bound TRAIL as determined by flow cytometry was higher on CD4(+) and CD8(+) T cells from lupus patients compared to controls, particularly on activated CD69(+)CD8(+) T cells. Similarly, sTRAIL levels determined by ELISA were significantly elevated in serum from patients with active SLE and correlated with levels of IFNalpha. In vitro, both T-cell-associated and sTRAIL were maximally induced by T cell activation plus IFNalpha in patients and controls. By Western blot analysis, sTRAIL was detected in sera in both the monomeric and multimeric, functional form. Both forms of TRAIL were functional in vitro as determined by Annexin V staining and (51)Cr release assay but the apoptotic activity of membrane TRAIL was 2.5-fold higher compared to that of sTRAIL. These results indicate that IFNalpha-induced enhancement of TRAIL expression and of TRAIL-mediated apoptosis may amplify the abnormal apoptotic process in SLE.     

The Effect of N-nitrosodimethylamine on TRAIL and DR5 expression in human neutrophils--preliminary study

The intracellular mechanisms of NDMA-induced apoptosis of neutrophils have not yet been fully understood. The aim of this study was to explain whether the TRAIL/DR5 system is implicated in NDMA-induced apoptosis of human neutrophils. The expression of TRAIL and DR5 was examined, as well as the secretion of sTRAIL and sDR5 by human neutrophils treated with NDMA confronted with intensity apoptosis of these cells. For comparative purposes similar examinations in autologous peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were performed. Decreased expression and secretion of TRAIL and increased expression and secretion of DR5 associated with increased intensity of apoptosis of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) suggest that NDMA-induced apoptosis in these cells may be depend on TRAIL/DR5 system. Autologous PBMCs no exerted that changes in the expression and secretion of TRAIL as well as in the intensity of apoptosis. However, the expression and secretion of DR5 by PBMCs were similar to those by PMNs. Differences above suggest that PMNs are more sensitive to unfavorable action of NDMA than PBMCs.     

NKG2D regulates production of soluble TRAIL by ex vivo expanded human γδ T cells

Soluble TRAIL (sTRAIL) can be produced by myeloid‐derived cells to kill cancer cells. Whether this mechanism is used by T cells, and if so, how sTRAIL production is regulated, remains unclear. Our previous studies showed that ex vivo expanded human γδ T cells express TRAIL and NK receptor group 2 (R2), member D (NKG2D), and possess potent anticancer activities both in vitro and in vivo. Here, we investigated in greater detail the mechanisms by which γδ T cells utilize TRAIL and NKG2D to kill lung cancer cells. We demonstrate that human lung cancer cells express TRAIL R2 and NKG2D ligands. Blocking TRAIL or NKG2D during γδ T‐cell‐lung cancer cell co‐cultures significantly reduced γδ T‐cell‐mediated cytotoxicity. Cross‐linking NKG2D with anti‐NKG2D antibody to mimic ligand binding promoted γδ T cells to produce sTRAIL, which induced apoptosis in lung cancer cells through TRAIL R2. Either neutralizing sTRAIL or blocking lung cancer cell TRAIL R2 significantly reduced γδ T‐cell‐mediated cytotoxicity to lung cancer cells. This study demonstrates that γδ T cells can mediate anticancer immunity via NKG2D‐regulated production of sTRAIL.     

重组人可溶性TRAIL的制备及其联合硼替佐米诱导肿瘤细胞的凋亡作用

目的:构建重组人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)原核表达质粒p ET-28a(+)-TRAIL114-281,优化蛋白表达和纯化条件,制备重组人可溶性TRAIL并鉴定其活性。方法:使用CCK-8初步验证TRAIL是否具有抑制肿瘤细胞生长的生物活性;将制备的TRAIL单独或联合50 nmol/L硼替佐米应用于H460细胞(对TRAIL敏感)和K562细胞(对TRAIL抵抗)24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测caspase-8、-9、-3的活化程度,Western blot分析细胞中Bax、Bcl-2和c FLIP蛋白的表达。流式细胞术检测硼替佐米处理H460细胞和K562细胞24 h后DR4和DR5的表达量变化。结果:制备了具有生物学活性且性质稳定的重组人可溶性TRAIL,且成功诱导H460和K562细胞凋亡。不同浓度TRAIL处理H460细胞后其凋亡率随着TRAIL浓度升高而显著升高(P0.05),但K562细胞凋亡率并未随着TRAIL浓度明显升高。联合用药组的H460和K562细胞凋亡率均显著高于单独用药组(P0.05),凋亡过程中caspase-8、-9、-3均被活化,药物处理组的Bcl-2和c FLIP表达量均比对照组下降,尤其联合用药组表达量下降最为显著(P0.05),而Bax表达量无明显变化。硼替佐米处理H460和K562细胞后DR4和DR5表达量均上调(P0.05)。结论:硼替佐米能协同TRAIL启动内源性凋亡途径诱导H460和K562细胞凋亡,其可能机制是通过上调死亡受体DR4和DR5的表达量、下调抗凋亡蛋白Bcl-2和c FLIP的表达量来实现的。     

TRAIL联合紫杉醇诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡作用研究

目的:观察紫杉醇联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的作用及其协同作用机制。方法:将TRAIL、紫杉醇及TRAIL联合紫杉醇诱导SGC-7901细胞48小时,用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和线粒体跨膜电位的改变;用MTT法检测SGC-7901细胞增殖反应;用免疫印迹(Westernblot)法检测TRAIL死亡受体DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)的表达变化。结果:TRAIL和/或紫杉醇对SGC-7901细胞增殖有抑制作用,两者联合用药组对细胞增殖的抑制率较单独用药明显增加(P<0.01);联合用药组细胞凋亡率较单独用药组明显增加(P<0.01);0.3μmol/L紫杉醇作用48小时后,DR4表达明显升高(P<0.05),而DR5表达没有明显改变(P>0.05)。结论:紫杉醇可协同TRAIL诱导SGC-7901细胞凋亡,DR4表达增加可能是其协同作用的机制。     

重组人可溶性TRAIL分子诱导白血病细胞株凋亡的研究

比较重组人可溶性TRAIL(rhsTRAIL)诱导Jurkat细胞株、K562细胞株以及HL-60细胞株凋亡之间的差异,探讨这些差异与细胞表面TRAIL受体(DR4、DR5、DcR1和DcR2)表达量的关系。不同浓度的rhsTRAIL分别处理Jurkat细胞、K562细胞和HL-60细胞12 h、24 h和48 h后,用流式细胞仪检测经碘化丙啶(PI)染色后的细胞凋亡情况;用RT-PCR方法检测细胞表面受体DR4、DR5、DcR1、DcR2的表达。培养12 h、24 h、48 h后,不同浓度rhsTRAIL诱导Jurkat细胞株的凋亡率均明显高于对照组,且具有剂量依赖性和时间依赖性;但K562细胞株和HL-60细胞株未见明显的凋亡发生。RT-PCR结果显示,培养12 h、24 h、48 h后,Jurkat细胞株表面DR4的表达随时间的延长和rhsTRAIL浓度的升高而升高,而DR5、DcR1和DcR2的表达未检出;K562和HL-60细胞株表面DR4的表达没有明显变化,而且DR5、DcR1和DcR2的表达也未检出。rhsTRAIL诱导Jurkat细胞株的凋亡具有剂量依赖性和时间依赖性,且与其细胞表面DR4的表达呈正相关;在一定的浓度条件下,rhsTRAIL未能诱导K 562和HL-60细胞株发生明显凋亡,且其细胞表面DR4的表达也未见明显变化。这些结果提示,应用TRAIL治疗不同种类白血病时,应注意它的使用剂量和适应范围。