百里醌抑制乳腺癌血管生长的实验研究

 目的: 探讨百里醌对乳腺癌血管生长的作用于及其机制。方法: 不同浓度百里醌作用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)及人乳腺癌细胞株MCF-7后,应用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,小管形成实验检测内皮细胞体外小管形成能力,Western blot法检测内皮细胞中cleaved caspase-3、p-ERK及p-AKT的蛋白水平;建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,完全随机法分成对照组和百里醌组,免疫组织化学法检测乳腺肿瘤组织中CD31的表达,TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡。结果: 百里醌(20~80 nmol/L)对MCF-7细胞生长无明显抑制作用,20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于内皮细胞24 h后,细胞存活率分别为(74.3±5.9)％、(68.7±5.6)％和(47.9±4.3)％;20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于MCF-7细胞24 h后,细胞凋亡率分别为(2.6±0.3)％、(2.4±0.3)％和(4.6±0.4)％,而相应的内皮细胞凋亡率分别为(21.5±3.7)％、(23.8±2.9)％和(27.8±3.1)％,内皮细胞较乳腺癌细胞对百里醌反应更敏感(P<0.05);20 nmol/L、40 nmol/L和80 nmol/L百里醌作用于内皮细胞1 h后,内皮细胞小管形成长度分别为(0.88±0.12)mm、(0.76±0.10)mm和(0.54±0.08)mm,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);80 nmol/L百里醌作用于内皮细胞24 h后,内皮细胞中cleaved caspase-3的水平上调, AKT和ERK磷酸化被抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化检测移植瘤组织中CD31结果显示,百里醌组IA值明显少于对照组(P<0.05);TUNEL检测结果显示,百里醌组IA值明显增大(P<0.05)。结论: 百里醌可抑制体内外乳腺癌血管生长,降低p-ERK及p-AKT的水平可能是其作用机制之一。     

NK4基因在人胰腺癌细胞中的表达及其对血管内皮生长的影响

目的:构建NK4基因真核表达载体并进行转染研究。方法:对重组质粒pcDNA3/hNK4进行酶切,将目的基因NK4克隆到较强的真核表达载体pRC/CMV2中,应用脂质体将NK4基因转染到胰腺癌细胞株SW1990中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用RT-PCR及Western blot鉴定及筛选出高转录和高表达的细胞克隆。以MTT法检测转染重组质粒pRC/CMV2-hNK4的细胞克隆表达产物对血管内皮细胞生长的影响。结果:在转染NK4基因的SW1990细胞克隆中,RT-PCR能扩增出NK4 mRNA预期的453bp片段,但强弱不同,Western blot显示均有约50 kD的NK4蛋白的表达。其上清可显著抑制血管内皮细胞的生长。结论:重组质粒pRC／CMV2-hNK4是一种高效真核表达载体,并且能够在SW1990细胞中高表达;NK4能够抑制血管内皮细胞的生长,提示其在肿瘤基因治疗中可能具有重要意义。     

治疗胰腺癌药物的新发现：百里香醌

美国费城Thomas Jefferson大学Kimmel癌症研究中心的科研人员发现，一种在中东国家常用的中药材——百里香醌（黑种草籽油提取物）能诱导胰腺痛细胞发生凋亡并抑制癌细胞生长。Jefferson医学院外科助理教授Hwyda Ararat博士于2008年5月18日在美国圣地亚哥召开的“消化疾病周”（DDW）会议上发表了该项研究结果。     

胰腺癌淋巴管生成及其与生物学行为关系

目的研究胰腺癌淋巴管生成的机制、分布特征及其与胰腺癌临床病理学的关系。方法应用免疫组化双标记方法检测42例胰腺癌和12例癌旁胰腺组织中血管内皮生长因子-C（VEGF—C）及肾小球足突细胞黏蛋白（Podoplanin）的表达。结果42例胰腺癌组织VEGF—C阳性率为61．9％,12例癌旁胰腺组织中VEGF—C阳性表达率为58．3％,两者差异无显著性（x^2=0．050,P〉0．05）。VEGF-C阳性率与胰腺癌的淋巴结转移有密切关系（x^2=4．822,P〈0．05）,而与胰腺癌大小、组织学分级、神经浸润及临床病理分期无关（P〉0．05）。胰腺癌组织中可见明确的Podoplanin阳性淋巴管,其数目和分布具有明确的异质性。肿瘤边缘组织中淋巴管数最多,其次为肿瘤表浅部,而肿瘤中心区最少;在形态上,肿瘤边缘可以见到较多管腔扩张的淋巴管,而肿瘤中心及表浅淋巴管多为闭锁的条索状或点状。癌旁胰腺中Podoplanin阳性淋巴管分布在呈慢性炎症的胰腺组织周围,多数呈扩张状态。42例胰腺癌组织中LVD为7．67±1．25,12例癌旁胰腺组织中LVD为7．85±0．93,二者差别无显著性（t=0．639,P〉0．05）。胰腺癌组织中LVD与淋巴结转移及临床病理分期有关（t=7．076,6．803,P〈0．01）,而与胰腺癌大小、组织学分级和神经浸润无关（P〉0．05）。胰腺癌组织中VEGF-C的表达与LVD间呈正相关性（r=0．509,P〈0．05）。结论胰腺癌及癌旁胰腺组织中VEGF—C高表达,促进淋巴管增生,可能是临床上胰腺癌早期发生淋巴结转移的重要机制之一。     

血管内皮生长因子对外周血内皮祖细胞功能的影响

目的: 观察不同浓度血管内皮生长因子(VEGF）对体外培养人外周血内皮祖细胞（EPCs）生物学功能的影响，探讨VEGF促进EPCs分裂生长的合适浓度。方法: 密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞（MNCs），接种至人纤维连接蛋白（HFN）包被的培养板上，培养4 d后收集贴壁细胞，换用配有不同浓度（对照组、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L）VEGF的培养基继续培养3 d后进行细胞免疫组化鉴定EPCs，采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验，观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果: 从人外周血能成功分离EPCs细胞，并能分化为血管内皮细胞；从冠心病患者分离的EPCs增殖能力较非冠心病患者弱；VEGF在较低浓度（10 μg/L和20 μg/L）时即能显著促进EPCs生长的各项生物学指标，但高浓度（50 μg/L）时并不能进一步增强这一效应；低浓度（10 μg/L）下VEGF对冠心病患者作用较非冠心病患者弱，高浓度时对两者促进作用相近。结论: 冠心病患者EPCs功能显著减弱，较低浓度的VEGF即可显著增强EPCs的各项生物学功能，可能对损伤血管的再内皮化有益。     

表皮生长因子及其抗体对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

在原代培养中添加大豆胰蛋白酶抑制剂，成功地建立了一株新的人胰腺癌细胞系ＰＣ一７。该细胞系经形态学和生物学研究证实为人胰腺癌细胞系。染色体核型分析和流式细胞ＤＮＡ含量分析表明ＰＣ一７细胞系为低二倍体。应用此细胞系建成的裸鼠移植瘤模型，观察表皮生长因子（ＥＧＦ）及其抗体（抗一ＥＧＦ）对裸鼠移植瘤生长的影响，发现ＥＧＦ组和抗一ＥＧＦ组分别是对照组肿瘤重量的１３８％和６７％。组织学和超微结构研究表明：ＥＧＦ组的核分裂明显多于对照组，而抗一ＥＧＦ组则少于对照组．结果表明ＥＧＦ促进ＰＣ一７裸鼠移植瘤的生长，而抗一ＥＧＦ抗体可部分地抑制ＰＣ一７移植瘤的生长。     

内皮祖细胞与肿瘤血管新生

血管内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞,特异性表达CD34,CD133和VEGFR-2,具有向血管内皮细胞分化的潜能。EPCs主要位于骨髓和外周血。肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生。肿瘤细胞可合成和释放多种细胞因子,在不同因子的趋化作用下EPCs从骨髓动员至外周血循环,然后迁移和定居到肿瘤组织,经细胞因子诱导分化为成熟内皮细胞,参与肿瘤血管新生。VEGF/VEGFR-2信号途径在EPCs参与的肿瘤血管新生方面起重要作用。     

VEGF与肿瘤血管生成及抗血管生成基因治疗

ＶＥＧＦ是一种重要的血管生成因子，已发现许多生长因子如ＥＧＦ，ＰＤＧＦＢＢ，ｂＦＧＦ，ＴＧＦβ等都是通过诱导ＶＥＧＦ的表达而起作用的。ＶＥＧＦ 可改变内皮细胞基因的活化形式，增强血管通透性，诱导血管生成。目前抗血管生成基因治疗是肿瘤治疗研究的热点，大多数肿瘤表达高水平ＶＥＧＦ，且其表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。     

内皮祖细胞移植对血管内膜修复的影响

目的： 从脾源性单个核细胞中分离并扩增血管内皮祖细胞（EPCs）,研究EPCs移植对血管损伤后内膜修复的影响。 方法: 大鼠脾源性单个核细胞贴壁培养法定向扩增EPCs，检测其内皮细胞特性。荧光标记EPCs从尾静脉移植到颈动脉内皮损伤的大鼠体内。 结果: 脾源性单个核细胞体外可诱导出内皮祖细胞，表现为表达内皮细胞特异性标志。移植后，EPCs可归巢至血管损伤部位。EPCs移植组在球囊损伤2周后血管新生内膜明显减少，血管腔狭窄程度显著减轻。EPCs移植组新生内膜/中膜比值显著低于单纯球囊损伤组及M199组(0.82±0.09 vs 1.52±0.21, 1.48±0.19,P＜0.01)。EPCs移植组PCNA 阳性表达细胞明显少于单纯球囊损伤组及M199组（19.25±3.96 vs 31.42±5.23, 29.37±3.16, P＜0.05）。 结论: EPCs能有效移植到内皮损伤血管段，参与损伤血管的内膜修复过程。     

β-拉帕醌对胃癌细胞生长与侵袭的抑制作用及机制

目的：探讨β-拉帕醌体外抑制胃癌细胞增殖和迁移及诱导凋亡的作用及机制。方法应用噻唑蓝（ MTT）及平板克隆实验检测β-拉帕醌对SGC-7901与AGS胃癌细胞增殖的影响,划痕实验检测β-拉帕醌抑制胃癌细胞的迁移能力,流式细胞术检测β-拉帕醌诱导胃癌细胞凋亡的作用。应用Western b1ot法检测β-拉帕醌处理胃癌细胞前后其增殖、迁移、上皮-间质转化（ epithe1ia1-mesenchyma1 transition,EMT）及凋亡分子标志物的变化。结果β-拉帕醌可显著抑制SGC-7901和AGS胃癌细胞的增殖能力,并下调增殖与周期相关Skp2和DEK蛋白的表达（ P均<0.05）;经β-拉帕醌处理后,胃癌细胞的迁移能力明显下降,且显著下调MMP-2/9和Ezrin蛋白以及EMT间质标志物的表达,上调EMT上皮标志物表达水平;另外,β-拉帕醌增加胃癌细胞的凋亡,下调BCL-2/Bax比值以及上调活化型Caspase-3/8/9的表达。结论β-拉帕醌对胃癌细胞有明显的抑制增殖及诱导凋亡的作用,并可通过MMPs和EMT途径抑制胃癌细胞的迁移能力。     

促红细胞生成素促进内皮祖细胞增殖的体外研究及机制探讨

目的：研究人重组促红细胞生成素（rhEPO）对人内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响并探讨其作用机制。方法: 以不同浓度rhEPO分别作用于15例处于肾衰竭期的患者以及15例健康志愿者EPCs，MTT法检测其增殖，Annexin-V法检测其凋亡，Western blotting法检测Akt蛋白激酶。结果: 100 U/L、600 U/L及1 200 U/L rhEPO均能提高实验组和对照组EPCs的数量及增殖能力，呈剂量依赖性，实验组EPCs数量及功能均显著低于对照组。1 200 U/L rhEPO能显著降低EPCs的凋亡率，提高 Akt蛋白激酶的表达。加入Wortmannin后能阻断这一效应。结论: rhEPO可以显著提高健康人群和肾衰竭患者EPCs的数量与功能，且这一效应与PI3K/Akt信号通路有关。     

Endothelial dysfunction—An obstacle of therapeutic angiogenesis

Due to ageing populations and improvements in survival, increasing numbers of patients suffering from ischemic cardiovascular disease are not amenable to revascularization. Hence, interests are currently focused on “therapeutic angiogenesis”, which is the clinical use of growth factors to enhance or promote the development of collateral blood vessels in ischemic tissue. Several growth factors (or genes encoding these growth factors) are now available for therapeutic vascular growth in normal and ischemic tissues. However, the successes of angiogenic therapy observed in pre-clinical studies have not been realized in clinical trials. Most animal studies demonstrating the physiologic effectiveness of angiogenic therapies have been performed in normal young animals, while clinical trials typically enroll older patients with various endothelial disruptive risk factors. The promising results of trials using endothelial function-improving strategies support the hypothesis that the decreased effectiveness of growth factor therapy due to endothelial dysfunction could be a principle reason for failure of trials using growth factors. We will have a retrospection of therapeutic angiogenesis trials and discuss the mechanisms that contribute to an impaired angiogenic response in the setting of endothelial dysfunction. We also briefly explore endothelial function-improving procedures that have the potentially therapeutic benefit of enhancing the angiogenic response.     

As2O3对胰腺癌细胞株的抑制作用及其机制的初步探讨

目的：探讨三氧化二砷（arsenous oxide，As2O3）对胰腺癌PC2细胞的抑制作用及其作用机制。 方法： 用胰腺癌PC2细胞株进行培养传代，观察As2O3作用于细胞的不同时间，对细胞生长抑制情况；利用TUNEL染色检测胰腺癌细胞凋亡率；RT-PCR方法检测survivin基因的表达。 结果： ①随着药物对胰腺癌细胞作用时间的延长，细胞生存率明显降低，药物作用存在时间依赖性（P<0.05，P<0.01）。②TUNEL染色证实，As2O3对胰腺癌细胞的抑制作用是以促进细胞凋亡为主。③凋亡抑制因子survivin基因在胰腺癌细胞中表达；胰腺癌细胞经As2O3作用后，抑制survivin基因的表达（P<0.05）。 结论： As2O3可能通过抑制凋亡抑制因子survivin基因的表达，促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用。     

敲减STAT3基因表达对胰腺祖细胞增殖的影响

目的:探讨敲减信号转导和转录激活因子3(STAT3)基因的表达对胰腺祖细胞增殖的影响。方法:将靶向STAT3基因的小干扰RNA(siRNA)转染胰腺祖细胞,采用qPCR和Western blot验证STAT3基因表达下调,通过光学显微镜、活细胞计数法和CCK8法检测STAT3基因沉默对胰腺祖细胞增殖和活力的影响,流式细胞术检测细胞周期进程的变化,Western blot检测细胞周期蛋白D2(CCND2)的表达水平。结果:干扰片段有效沉默STAT3基因的表达,STAT3的蛋白表达水平降低了(78.62±0.08)%,与对照组相比,敲减STAT3基因的表达使胰腺祖细胞数量减少了(45.62±0.03)%,活力降低了(43.68±0.05)%,细胞周期阻滞在G 0/G 1期,CCND2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:敲减STAT3基因表达通过抑制CCND2蛋白表达,阻滞细胞周期在G0/G1期,抑制胰腺祖细胞的增殖和活力。     

反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭和迁移的抑制作用

目的:探讨微小RNA-196a(miR-196a)在胰腺癌细胞系中表达状况及反义miR-196a对人胰腺癌PANC-1细胞生物学行为的影响。方法:miR-196a采用实时荧光定量PCR检测。人工化学合成反义miR-196a并转染PANC-1细胞。CCK-8法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡情况。通过划痕损伤实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验检测PANC-1细胞侵袭和迁移能力。构建野生型及突变型核因子κB抑制蛋白α(NFKBIA)3'UTR的萤光素酶报告载体,检测海肾萤光素酶的相对活性以验证miR-196a对NFKBIAmRNA的作用靶点。结果:人胰腺癌细胞系中miR-196a呈高表达;转染反义miR-196a后,PANC-1细胞miR-196a表达下降,其细胞增殖和凋亡无显著改变(P>0.05);而转染反义miR-196a组中通过Transwell小室的细胞数明显低于各对照组(P<0.01)。与各对照组相比,共转染野生型NFKBIA的3'UTR和反义miR-196a可使海肾萤光素酶相对活性显著提高。结论:miR-196a可能是癌微RNA(oncomiR)之一,有望成为人胰腺癌基因治疗的候选靶点。     

应用光谱染色体核型分析技术研究胰腺癌细胞系P2染色体核型

目的 探讨胰腺癌的细胞遗传学特征.方法 采用光谱核型分析技术对中国人胰腺癌细胞系P2的染色体核型进行分析,并选择EGFR/CEP 7双色荧光原位杂交(FISH)探针,对比分析10例胰腺癌和10例慢性胰腺炎石蜡标本的EGFR基因拷贝数,验证光谱核型分析结果.结果 P2细胞系为亚三倍体核型,共发现26种染色体异常,其中重复出现的染色体异常改变为染色体4、9、18、19、22、Y、10p、15p、8p、6q和12p缺失,染色体7和12q增加,以及染色体结构畸变der(9;15)(q10;q10)、der(10)(3;10)(?;q26)和der(12)(8;12)(?;p13).EGFR-FISH阳性为4/10.结论 胰腺癌细胞系的染色体重排非常复杂,进一步扩大样本量进行相关分析,包括了解胰腺癌的EGFR-FISH阳性率非常有必要.     

小白菊内酯对胰腺癌细胞BxPC-3增殖和凋亡的影响及机制

目的： 探讨小白菊内酯对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响及其可能的分子机制。方法: 应用MTT法观察不同浓度小白菊内酯对BxPC-3细胞增殖的影响；流式细胞术及DNA梯状电泳（DNA ladder）检测BxPC-3细胞凋亡的改变；Western blotting法检测不同浓度小白菊内酯作用下BxPC-3细胞COX-2蛋白水平的改变，RT-PCR法检测COX-2 mRNA水平的变化。 结果: MTT、流式细胞术及DNA ladder显示小白菊内酯呈剂量依赖性地抑制BxPC-3细胞的增殖，并诱导其凋亡； Western blotting和RT-PCR法显示随着药物浓度的增加，COX-2蛋白及mRNA表达降低。结论: 小白菊内酯对人胰腺癌BxPC-3细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，这种效应可能与COX-2表达有关。     

抑制囊泡转运对大鼠内皮祖细胞增殖及钙库操纵性钙内流的影响

 目的: 研究囊泡转运在大鼠内皮祖细胞(EPCs)增殖及钙库操纵性钙内流(SOCE)调控中的作用。方法: 密度梯度离心法分离获取、并用acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双染鉴定脾源性EPCs。布雷菲德菌素A(BFA)抑制囊泡转运,CCK-8法和实时无标记细胞功能分析仪观察EPCs增殖变化,流式细胞术检测凋亡情况,并检测囊泡转运关键蛋白ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ARFGAP1)的表达。激光共聚焦显微镜观察囊泡转运抑制后SOCE并用Western blot检测SOCC复合体蛋白表达,进一步采用RNA干扰的方式观察囊泡转运对瞬时受体电位通道1(TRPC1)蛋白表达及SOCE的影响。结果: 双染鉴定大鼠脾源性EPCs阳性率为82.53%±6.12%。BFA显著抑制EPCs的增殖但对凋亡无明显影响,同时ARFGAP1表达也明显降低,说明EPCs的囊泡转运受到抑制。抑制EPCs囊泡转运显著下调TRPC1的表达,并降低SOCE。siTRPC1使EPCs的SOCE下降,但si-TRPC1预处理并抑制囊泡转运并没有使EPCs的SOCE进一步降低。结论: 抑制EPCs的囊泡转运可以抑制EPCs的增殖并通过下调TRPC1的表达降低SOCE水平。     

高糖对糖尿病患者内皮祖细胞增殖凋亡的影响及其机制探讨

目的：了解葡萄糖对糖尿病患者内皮祖细胞（EPCs）增殖及凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法：以不同浓度葡萄糖分别作用于25例正常人(对照组)和25例2型糖尿病患者(糖尿病组)EPCs，MTT法检测其增殖，Annexin-V/PI法检测其凋亡。RT-PCR法检测bcl-2和bax的表达水平。结果：33 mmol/L葡萄糖使糖尿病组和对照组EPCs增殖率均减低，凋亡率增高；且能使糖尿病组和对照组EPCs表达bax增强，bcl-2表达无明显改变。而5 mmol/L葡萄糖作用下糖尿病组和对照组EPCs增殖率、凋亡率及bax和bcl-2表达无明显改变。结论：高糖使EPCs增殖功能减弱，凋亡增加，bax表达增加可能是其机制之一。