Smad通路参与ERK通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程

目的： 探讨Smad通路是否参与细胞外信号调节激酶(ERK)通路诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的过程及其可能机制。方法：将人脐动脉平滑肌细胞（hUASMCs）分为对照组、血小板源性生长因子（PDGF）组、ERK阻断剂组和PDGF+ERK阻断剂组。用MTT法测hUASMCs的增殖活性(A值)，用免疫组化法测hUASMCs内细胞核增殖抗原（PCNA）、磷酸化ERK和磷酸化Smad蛋白的表达，用RT-PCR法测hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达。结果：PDGF组hUASMCs的增殖活性(A值)及hUASMCs内的PCNA、磷酸化ERK和磷酸化Smad2/3蛋白的表达都明显高于其它各组(P<0.01)；各组hUASMCs内Smad2/3 mRNA的表达没有差异。结论： Smad通路可在蛋白水平参与ERK通路诱导VSMCs的增殖过程。     

阿司匹林对高糖和高胰岛素诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：探讨阿司匹林对高糖和高胰岛素诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及相关机制。方法：组织贴块法培养原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞, 用高糖和高胰岛素诱导细胞增殖。实验设对照组、高糖和高胰岛素组(HGI)、HGI +阿司匹林（0.5,1.25,2.50 mmol/L）组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定VSMCs增殖;一氧化氮(NO)试剂盒检测培养基上清液NO含量;流式细胞仪检测细胞周期。结果：阿司匹林呈剂量依赖性地抑制高糖和高胰岛素诱导的动脉VSMCs增殖,最大抑制作用出现在2.50 mmol/L阿司匹林培养5 d时(P<0.01);阿司匹林（2.50 mmol／L）干预可使高糖和高胰岛素导致下降的NO含量上升 (P<0.01);与高糖和高胰岛素组比较,阿司匹林(2.50 mmol/L)可使细胞静止期/DNA合成前期(G0/G1期)的VSMCs所占比例显著升高(P<0.05),而DNA合成期(S 期)细胞所占比例显著降低(P<0.05)。结论：阿司匹林能呈剂量依赖性地抑制高糖和高胰岛素诱导的动脉VSMCs的增殖,抑制细胞在G0/G1期,促进动脉平滑肌细胞NO的产生。     

TRPC6在PDGF诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

 目的：探讨经典瞬时受体电位通道6 (TRPC6) 对血小板源性生长因子 (PDGF) 诱导的气道平滑肌细胞 (ASMCs) 增殖的影响。方法：组织贴块联合酶消化法培养原代大鼠ASMCs。间接免疫荧光法鉴定平滑肌细胞及检测TRPC6在ASMCs上的表达。CCK-8法检测PDGF诱导ASMCs的增殖。Real-time PCR 检测PDGF作用后TRPC6 mRNA的表达。Western blotting检测PDGF作用后TRPC6蛋白的表达。CCK-8法检测TRPC6阻断剂对PDGF 诱导ASMCs增殖的作用。结果：细胞免疫荧光显示：TRPC6广泛存在于气道平滑肌细胞。CCK-8法检测细胞的增殖发现,20 μg/L PDGF作用后 ASMCs发生增殖 (P<0.05);PDGF与TRPC6阻断剂SKF96365共同作用于ASMCs,ASMCs的增殖较单独使用PDGF组减弱 (P<0.05),且减弱的程度具有剂量及时间依赖性。Real-time PCR结果显示：PDGF分别作用于ASMCs 12 h、24 h和48 h后,TRPC6 mRNA表达与相应的对照组比较明显升高 (P<0.05)。Western blotting检测结果显示：PDGF分别作用ASMCs 24 h和48 h后,TRPC6蛋白表达与相应的对照组比较明显升高 (P<0.05)。结论：TRPC6参与了PDGF诱导ASMCs增殖的过程,PDGF促进ASMCs增殖可能与其上调TRPC6 mRNA和蛋白表达相关。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

黄芪多糖对高糖所致血管平滑肌细胞增殖变化的影响

目的: 旨在观察体外高糖环境对大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)所致的增殖变化以及黄芪对其的影响。方法: 原代培养VSMC,分为正常对照组、25 mmol/L高糖剌激组、高糖剌激加低、中、高浓度黄芪多糖组(终浓度分别为100、200 和400 mg/L)。MTT方法分析细胞增殖率,RT-PCR检测分析MKP-1 mRNA转录及用ELISA法检测炎症因子MCP-1水平。结果: 与对照组相比高糖可以诱导VSMCs增殖(P<0.05),而中、高浓度黄芪多糖可以显著抑制该作用(P<0.05);高糖环境明显下调MKP-1 mRNA表达(P<0.05),但低浓度黄芪多糖可使MKP-1 mRNA上调,恢复到正常水平,在中、高浓度黄芪多糖时可使MKP-1 mRNA上调,显著高于对照组;高糖刺激组可促使VSMCs MCP-1分泌明显升高,低浓度黄芪即可降低高糖诱导MCP-1的水平(P<0.05),在高浓度组最明显。结论: 黄芪多糖防治糖尿病心血管并发症的作用可能与上调MKP-1 mRNA表达、抑制VSMCs增殖和MCP-1分泌相关。     

内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的大鼠平滑肌细胞增殖迁移

目的： 探讨内皮细胞Jagged1表达对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖迁移的调节作用。方法: 分离培养大鼠主动脉内皮和平滑肌细胞,将内皮接种于下室、平滑肌接种于上室建立细胞共培养体系,根据内皮是否行Jagged1小RNA干扰分为对照组、空载体组和Jagged1小RNA干扰组。用Western blotting检测内皮细胞Jagged1的干扰效率。于下室加入PDGF（10 μg/L）干预24 h后分别用［3H］-TdR 掺入和平滑肌迁移计数检测平滑肌细胞增殖迁移能力,用Western blotting检测平滑肌细胞α-SM-actin蛋白表达。结果: 与对照组相比空载体组内皮细胞Jagged1蛋白表达无明显差异,Jagged1小RNA干扰组内皮细胞Jagged1蛋白吸光度相对值明显降低（0.26±0.02 vs 0.67±0.02, P<0.05）;PDGF+空载体组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌［3H］-TdR 掺入量和迁移数高于PDGF组{［3H］-TdR 掺入(23 074±2 702)counts·min-1·well-1 vs (16 442±1 803)counts·min-1·well-1,n=5,P<0.05;迁移(27±4)cells/field vs (15±3) cells/field, n=5,P<0.05};PDGF+空载体组平滑肌α-SM-actin蛋白表达与PDGF组相比无明显差异,PDGF+Jagged1小RNA干扰组平滑肌α-SM-actin吸光度相对值低于PDGF组（0.25±0.06 vs 0.49±0.04, n=3,P<0.05）。结论: 内皮细胞Jagged1下调促进PDGF诱导的平滑肌细胞增殖迁移,提示血管内皮细胞Jagged1表达在维持平滑肌收缩表型、抑制平滑肌过度增殖迁移中起一定调控作用。     

miR-26a在血小板源性生长因子B诱导小鼠主动脉平滑肌细胞表型转换的作用

目的探讨miR-26a在血小板源性生长因子B(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换中的调控作用。方法培养原代小鼠主动脉VSMCs,将细胞分空白对照组、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control组和PDGF-BB+anti-miR-26a组共4组。分别加入荧光蛋白(Ad-GFP)、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control和PDGFBB+anti-miR-26a,观察VSMCs的表型改变;用RT-qPCR及Western blot分别检测VSMCs中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、钙调节蛋白(calponin)基因的mRNA和蛋白表达水平以及VSMCs中miR-26a表达。结果与对照组相比,PDGF-BB以浓度和时间依赖方式抑制VSMCs分化标志基因α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的表达(P0. 05),诱导VSMC表型转换为合成表型; PDGF-BB处理的VSMCs中miR-26a表达显著升高(P0. 05);抑制miR-26a后,PDGF-BB对VSMCs的α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的抑制作用被部分抵消(P0. 05)。结论 PDGF-BB使VSMCs中miR-26a表达显著升高,miR-26a促进VSMCs增殖和迁移,miR-26a在PDGF-BB诱导VSMCs表型转换中可能起关键作用。     

脂联素抑制甲基环糊精包被的胆固醇诱导的人血管平滑肌细胞泡沫化

目的:体外研究脂联素(APN)对甲基环糊精包被的胆固醇(Chol:MβCD)诱导的人血管平滑肌细胞(VSMCs)泡沫化过程的影响,并探讨其可能的机制。方法:体外培养人主动脉平滑肌细胞,将细胞分为5组,即对照组(正常培养VSMCs)、泡沫细胞组(VSMCs与100 mg/L Chol:MβCD共孵育24 h)及低、中、高剂量APN组(在泡沫细胞组基础上分别加入2.5、5和10 mg/L APN干预24 h)。油红O染色及脂质含量计算分析各组细胞泡沫化情况,酶荧光法检测胞内胆固醇含量及细胞胆固醇流出率。RT-qPCR和Western blot法分别检测各组细胞内沉默信息调节因子1(SIRT1)和过氧化物酶增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)mRNA和蛋白的表达。结果:与对照组相比,泡沫细胞组胞质内可见大量红色脂滴聚集,胞核突出,胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的含量及CE/TC值均显著升高(P0.05),细胞胆固醇流出率增加(P0.05),符合泡沫细胞改变;SIRT1和PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P0.05)。APN干预可呈浓度依赖性降低泡沫细胞内脂质沉积(P0.05),减少胞内TC和CE含量及CE/TC值(P0.05),促进细胞胆固醇流出(P0.05);SIRT1和PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平随着APN浓度的升高而逐步升高(P0.05)。结论:APN在体外可呈浓度依赖性抑制Chol:MβCD诱导的VSMCs泡沫化,其机制可能与调控SIRT1/PGC-1α信号通路有关。     

抑制肌球蛋白轻链激酶活性对内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡失衡的影响

目的:观察抑制肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖与凋亡失衡的影响。方法:细胞分成3组:对照组;内皮素-1组;内皮素-1+肌球蛋白轻链激酶抑制剂组(ET-1+M组)。干预72 h后,免疫印迹法测定细胞内MLCK表达水平;甘油凝胶电泳和免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平,MTT比色法及[3H]-TdR掺入法检测PASMCs的增殖情况,流式细胞仪检测PASMCs的细胞周期变化及凋亡率。结果:同对照组比较,ET-1刺激后肺动脉平滑肌细胞MLCK蛋白表达显著增强、MLC磷酸化上调、增殖增多、凋亡率明显降低(均P0.05);加入MLCK抑制剂干预后,MLCK表达明显下降(P0.05)、MLC去磷酸化显著增强、逆转了ET-1对PASMCs增殖及凋亡的影响。结论:抑制MLCK能显著逆转内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的失衡。     

生理性周期性张应变通过激活AMPK磷酸化抑制血管平滑肌细胞迁移

目的 探讨细胞能量代谢的关键调节因子 AMP激活的蛋白激酶AMPK在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）响应生理性周期性张应变力学刺激后对VSMCs迁移的影响。方法 采用 Flexcell-5000T体外细胞张应变加载系统,对大鼠原代培养的 VSMCs 施加10%幅度、1.25 Hz 频率的周期性张应变,模拟VSMCs在体内的生理性力学环境;以未加载周期性张应变的静态细胞为对照组,Western blotting 检测 VSMCs的 p-AMPK蛋白表达;划痕实验检测 VSMCs 迁移功能。结果 与静态组的细胞相比,生理性周期性张应变加载24 h后显著减少划痕愈合面积,提示生理性周期性张应变抑制VSMCs迁移;生理性周期性张应变加载3 h后,VSMCs的p-AMPK蛋白表达显著升高,而加载24 h后p-AMPK蛋白表达显著降低。在生理性周期性张应变加载条件下,孵育AMPK抑制剂可以在张应变加载3 h后显著降低 p-AMPK蛋白表达,而在张应变加载24 h后显著促进VSMCs迁移;在静态条件下孵育AMPK激活剂 AICAR 3 h后显著诱导p-AMPK蛋白表达,孵育24 h后显著抑制VSMCs迁移;提示p-AMPK蛋白表达参与调控VSMCs迁移。结论 生理性周期性张应变能通过激活p-AMPK蛋白表达,进而抑制VSMCs迁移,提示生理性周期性张应变调控VSMCs迁移对维持血管稳态具有重要意义。     

胰升糖素样肽1对肥胖大鼠肝脏组织中Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的干预效应

目的:研究胰升糖素样肽1受体激动剂利拉鲁肽对肥胖大鼠肝脏组织Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为正常饮食组(NC组)与高脂饮食组(HF组),喂养12周后,每组取5只评估肥胖大鼠模型建立。HF组再随机分为HF组、低剂量利拉鲁肽组(LG组)、中剂量利拉鲁肽组(MG组)与高剂量利拉鲁肽组(HG组),各组分别给予生理盐水及不同剂量利拉鲁肽(50、100和200μg/kg,皮下注射,每天2次) 4周。16周时测定体重及附睾脂肪指数;取大鼠肝脏组织HE染色观察肝脏脂肪变性情况; Western blot法检测肝脏组织中Sesn2、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白水平。结果:HF组大鼠的体重明显高于NC组(P 0. 01)。HF组肝脏细胞出现脂肪变性。与NC组相比,HF组的Sesn2蛋白水平明显降低(P 0. 01),p-AMPK/AMPK水平明显降低(P 0. 01),而p-mTOR/mTOR水平与NC组相比差异没有统计学显著性。利拉鲁肽干预4周后,药物处理组大鼠体重明显低于HF组(P 0. 01),MG与HG组大鼠的附睾脂肪指数较HF组降低(P 0. 01),肝组织脂肪变性较HF组减轻; HG组的Sesn2蛋白水平明显高于HF组(P 0. 01),MG与HG组的p-AMPK/AMPK水平较HF组明显升高(P 0. 01),LG组、MG与HG组p-mTOR/mTOR水平较HF组明显降低(P 0. 01)。结论:胰升糖素样肽1受体激动剂可能通过Sesn2/AMPK/mTOR信号通路影响机体能量代谢,改善肥胖状态。     

慢性间歇性低氧对幼鼠脑区AMPK通路的影响

目的:探讨慢性间歇性低氧对幼鼠脑区腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路的影响。方法:第一部分:将3~4周龄的SD幼鼠随机分为4组(n=8):2周空气模拟对照(2AC)组、2周慢性间歇低氧(2IH)组、4周空气模拟对照(4AC)组和4周慢性间歇低氧(4IH)组。第二部分:将3~4周龄的SD幼鼠随机分为2组(n=8):4周慢性间歇性低氧组(4IH)和4周慢性间歇性低氧用药组(4IHI)。造模结束后行八臂迷宫测试,TUNEL法检测细胞凋亡,RT-qPCR法了解腺苷A2a受体的mRNA表达,Western blot法测定AMPK及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化水平。结果:与对照组相比,2IH组和4IH组的参考记忆错误(RME)、工作记忆错误(WME)和总错误(TE)次数明显增加,差异有统计学显著性(P0.01);4IH与2IH组比较,各项错误次数亦明显增加(P0.01)。4IHI组比4IH组RME、WME和TE次数减少,差异有统计学显著性(P0.01)。与对照组相比,2IH组和4IH组海马和前额皮层区的神经元凋亡增多,以4IH组凋亡明显(P0.05);4IHI组凋亡较4IH组减少(P0.05)。2IH组和4IH组海马和前额皮层区腺苷受体A2a的mRNA和AMPK磷酸化蛋白的水平升高,mTOR磷酸化蛋白的水平下降,4IH组较2IH组改变明显(P0.05)。4IHI组较4IH组海马和前额皮层区的AMPK磷酸化蛋白水平下降,mTOR磷酸化蛋白水平升高(P0.05)。结论:慢性间歇性低氧诱导神经元凋亡,从而引起幼鼠学习记忆障碍,呈时间依赖性。慢性间歇性低氧上调腺苷A2a受体,激活海马和前额皮层区AMPK,抑制mTOR的活性,诱导神经元凋亡,进而影响幼鼠学习记忆能力。     

基于AMPK/mTOR信号通路介导的自噬途径研究黄芪多糖对急性放射性肠炎大鼠肠黏膜的保护作用

目的:探究基于AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路介导的自噬途径研究黄芪多糖(APS)对急性放射性肠炎大鼠肠黏膜的保护作用.方法:对SD大鼠进行12 Gy单次照射,制备急性放射性肠炎模型,随机分为模型组、APS(2 g/kg)组、AMPK抑制剂compound C(CC,0.2 m...     

异丙基肾上腺素不同给药模式对小鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶活性的影响

目的:探讨β-肾上腺素受体(β-AR)激动剂异丙基肾上腺素(ISO)2种给药模式对小鼠心脏腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的影响,以及AMPK激动剂在这2种模式中对心脏结构和功能的不同作用。方法:采用皮下植入微渗透压泵的方法给予雄性BALB/c小鼠持续14 d输注ISO(5 mg·kg~(-1)·d~(-1))以及每日皮下注射AMPK激动剂AICAR(250 mg·kg~(-1)·d~(-1))。分别于植入泵14 d后和植入泵14 d并撤泵3 d后,利用超声心动图和血流动力学方法检测心脏功能并收集心脏样本。Western blot检测AMPK的磷酸化水平。结果:持续输注ISO14 d后心脏AMPK的磷酸化水平较对照组明显增加(P0.05),AICAR并不进一步增加AMPK磷酸化水平,反而有减少ISO引起的心脏AMPK磷酸化水平增加的趋势。AICAR明显抑制ISO引起的心脏重量增加。反映心脏收缩功能的左室短轴缩短率(FS)和左心室压力最大上升速率(+dp/dt_(max))在ISO组显著高于对照组(P0.05),AICAR并不进一步增加心脏收缩功能。反映心脏舒张功能的左室舒张末压(LVEDP)在各组并无明显改变。持续输注异丙基肾上腺素14 d并撤泵3 d后心脏AMPK的磷酸化水平与对照组的差异无统计学显著性。AICAR明显抑制ISO引起的心脏重量增加。+dp/dt_(max)在ISO组明显低于对照组(P0.05),提示收缩功能下降。AICAR+ISO组与ISO组相比,有增加+dp/dt_(max)的趋势。反映心脏舒张功能的LVEDP在ISO组明显升高(P0.05),提示舒张功能明显降低。而AICAR则显著改善了ISO引起的舒张功能异常(P0.05)。给予ISO后,AMPK磷酸化水平增加和心率增加的时间曲线一致,均为5 min开始升高,30 min开始下降至基础水平。结论:β-AR持续激动使AMPK活性持续升高,而撤泵后AMPK活性则降至对照水平。观察AMPK激动对心脏功能的改善作用需避免β-AR激动引起的正性变时变力效应的干扰。     

氯沙坦通过激活AMPK抑制LPS诱导的小鼠海马GFAP表达

目的:探讨氯沙坦对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,以及其机制是否与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。方法:将成年雄性昆明小鼠分为正常对照组、LPS模型组、氯沙坦给药组及氯沙坦与compound C合用组。侧脑室注射相同剂量LPS(24μg/d,每天1次,共2次),以建立中枢神经炎症损伤模型;氯沙坦(0.5、1或5 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前14 d开始连续每日腹腔注射给药;AMPK抑制剂Compound C(10 mg·kg~(-1)·d~(-1))于LPS注射前2 d开始连续每日腹腔注射给药。在LPS末次注射后的第3天取各组小鼠的海马脑区组织,利用Western blot法检测GFAP、AMPK、p-AMPK、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR的蛋白水平。结果:2次LPS注射后可显著诱导GFAP在海马脑区的表达(P0.01),而氯沙坦可浓度依赖地抑制LPS诱导的GFAP表达,当氯沙坦剂量为5 mg·kg~(-1)·d~(-1)时可显著抑制GFAP表达(P0.05),同时,在该剂量下,氯沙坦显著提高了AMPK的磷酸化水平(P0.01),但对mTOR的磷酸化水平无明显调节作用;而AMPK抑制剂Compound C可显著逆转氯沙坦对GFAP表达及AMPK磷酸化的调节作用(P0.05)。结论:氯沙坦可抑制LPS诱导的海马GFAP表达,该作用可能与其激活AMPK有关,但并不依赖于mTOR信号通路。     

黄芪多糖活化AMPK减轻游离脂肪酸对C2C12成肌细胞的细胞毒性

目的: 探讨黄芪多糖(APS)减轻游离脂肪酸(free fatty acids, FFAs)对骨骼肌细胞的毒性作用及其机制。方法: 培养C2C12成肌细胞分5组:对照组、APS组、5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside, AICAR)组、FFAs组和FFAs+APS组。MTT法检测C2C12细胞存活率;透射电镜观察细胞超微结构;Western blotting检测细胞内腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)表达水平;高效液相色谱法测定细胞胞浆AMP/ATP比值。结果: (1)与FFAs组比较,APS显著提高细胞存活率(P<0.05);(2)透射电镜观察发现,APS作用24 h后可以减轻FFAs导致的线粒体肿胀;(3)Western blotting结果显示:与FFAs组比较,APS作用24 h后显著增加p-AMPK表达(P<0.01)及 p-ACC表达(P<0.05),而不影响总AMPK表达 (P>0.05);(4)AMP/ATP比值检测结果:与FFAs组比较,APS作用24 ｈ后细胞内AMP/ATP比值增加 (P<0.01)。结论: APS可以减轻FFAs对骨骼肌细胞的毒性,其机制可能与保护线粒体、激活AMPK途径有关。     

山奈酚通过调控AMPK / Nrf2 / HO-1 信号通路缓解ox-LDL 介导的内皮细胞损伤

目的:探讨山奈酚(Kaempferol)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的影响及其分子机制。方法:将HUVECs 随机分为6 组:对照(control)组、ox-LDL 组、Kaempferol+ox-LDL 组、Kaempferol+ox-LDL+Compound C 组、Kaempferol+ox-LDL+si-Nrf2 组和Kaempferol+ox-LDL+si-HO-1 组。MTT 方法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡和ROS 水平,Western blot 检测蛋白表达水平。结果:与对照组相比,ox-LDL 处理组的细胞活力下降;凋亡率增加,Cleaved-caspase-3 蛋白水平上调而Bcl-2 下调;TNF-α、IL-1β、IL-6、血管细胞黏附分子(VCAM1)、细胞间黏附分子(ICAM1)和选择素E(E-selectin)的表达升高;活性氧簇(ROS)水平提高而超氧化物歧化酶(SOD)水平下降;p-AMPK、Nrf2 和HO-1 的蛋白水平也减少。与ox-LDL 组相比,山奈酚处理能够缓解以上细胞活力、凋亡及氧化应激等方面的损伤反应,上调p-AMPK、Nrf2 和HO-1 的蛋白水平。Compound C、si-Nrf2 和si-HO-1 处理能够抑制AMPK/ Nrf2/ HO-1 信号通路,提高ROS 的生成,抑制山奈酚对ox-LDL 诱导HUVECs 损伤的拮抗作用。结论:山奈酚能够缓解ox-LDL 诱导的内皮损伤,这与山奈酚促进AMPK/ Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。     

miRNA-126对肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EGFR/AKT/mTOR信号通路的影响

 目的: 探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-126对肺癌A549细胞功能的影响及相关的作用机制。方法: 利用脂质体试剂Lipofectamine 2000将miRNA-126转染入肺癌A549细胞中,采用real-time PCR法检测转染后各组细胞中miRNA-126的表达;MTT法检测细胞活力;台盼蓝拒染实验检测细胞存活数目;细胞集落培养实验观察转染后细胞集落形成;划痕愈合实验检测细胞的迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;Western blot法检测EGFR/AKT/mTOR通路中各蛋白水平的变化。结果: Real-time PCR结果显示,转染miRNA-126组细胞中的miRNA-126表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),而阴性对照组与空白对照组无显著变化;A549细胞转染miRNA-126模拟物后,细胞增殖和集落形成能力均呈明显下降(P<0.01);肺癌细胞的迁移和侵袭能力也受到明显抑制(P<0.01);Western blot结果显示,转染miRNA-126组细胞中EGFR/AKT/mTOR通路相关蛋白p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的水平均有明显降低(P<0.01)。结论: miRNA-126可以显著降低肺癌A549细胞中p-EGFR、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平,进而可能抑制其细胞增殖和迁移侵袭能力。     

A possible linkage between AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signalling pathway

BACKGROUND: The mammalian target of rapamycin (mTOR) regulates multiple cellular functions including translation in response to nutrients, especially amino acids. AMP-activated protein kinase (AMPK) modulates metabolism in response to energy demand by responding to changes in AMP. RESULTS: The treatment of SV40-immortalized human corneal epithelial cells (HCE-T cells) with 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR), widely used as an AMPK activator, inhibits p70 S6k activities. Altered glucose availability, which regulates AMPK activity, also modulates the activity of p70 S6k. AICAR treatment also inhibits phosphorylation of Thr-412 in the p70 S6 kinase (p70 S6k), which is indispensable for the activity. Furthermore, over-expression of mutant AMPK subunits by stable expression in rabbit pulmonary fibroblast cell lines (PS120 cells) also modulates p70 S6k activity. The insensitivity of the rapamycin-resistant p70 S6k variant to AICAR treatment suggests that the inhibition of p70 S6k is mediated through a common effector, supporting a model whereby mTOR and its downstream effector are controlled by AMPK. CONCLUSION: These results indicate that the AMPK and mTOR signalling pathways are possibly linked. In addition to the mTOR signal acting as a priming switch that modulates p70 S6k activation, AMPK appears to provide an overriding switch linking p70 S6k regulation to cellular energy metabolism.