Cathepsin B-RNAi-lentivirus inhibitis capillary-like tube formation in vitro

目的 探讨组织蛋白酶β-RNAi-慢病毒CathepsinB-RNAi-Lentivirus( CTSB-RNAi- LV)对体外类毛细血管形成的抑制作用. 方法 实验分为对照组和RNAi慢病毒组,采用免疫组织化学和构建体外类毛细血管模型的方法,检测CTSB-RNAi-LV转染小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain micvascular endothelial cells,bEND.3)后对Cathepsin B和类毛细血管形成的影响. 结果 免疫组织化学结果显示,bEND.3内Cathepsin B的表达呈棕褐色,主要位于细胞核周围,各组间Cathepsin B的表达以RNAi慢病毒组最少;bEND.3和培养基总蛋白测定与体外类毛细血管形成实验表明:RNAi慢病毒组总蛋白的含量和体外类毛细血管的形成区域明显低于其余两组,其组间比较有统计学意义(P＜0.05). 结论 CTSB-RNAi- LV能抑制bEND.3内Cathepsin B的表达和体外类毛细血管区域的形成.CTSB-RNAi-LV可靶向抑制体外类毛细血管的形成.     

组织蛋白酶B-RNAi-慢病毒对体外类毛细血管形成的抑制

目的 探讨组织蛋白酶β-RNAi-慢病毒CathepsinB-RNAi-Lentivirus（CTSB-RNAi -LV）对体外类毛细血管形成的抑制作用。方法 实验分为对照组和RNAi慢病毒组，采用免疫组织化学和构建体外类毛细血管模型的方法，检测CTSB-RNAi-LV转染小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain micvascular endothelial cells，bEND.3)后对Cathepsin B和类毛细血管形成的影响。结果 免疫组织化学结果显示，bEND.3内Cathepsin B的表达呈棕褐色，主要位于细胞核周围, 各组间Cathepsin B的表达以RNAi慢病毒组最少；bEND.3和培养基总蛋白测定与体外类毛细血管形成实验表明：RNAi慢病毒组总蛋白的含量和体外类毛细血管的形成区域明显低于其余两组，其组间比较有统计学意义（P＜0.05）。结论 CTSB-RNAi- LV能抑制bEND.3内Cathepsin B的表达和体外类毛细血管区域的形成。CTSB-RNAi- LV可靶向抑制体外类毛细血管的形成。     

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.     

大鼠β防御素2基因RNAi慢病毒载体的构建及效应测定

目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR(RT-PCR)及Western免疫印迹测rBD-2 mRNA及蛋白表达,筛选沉默效果最佳的为LV-shrBD2载体.用慢病毒包装系统对LV-shrBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度.结果 凝胶电泳显示3个RNAi慢病毒重组载体的PCR产物为316 bp,测序结果表明序列正确.转染细胞后RT-PCR及Western免疫印迹检测,siRNA序列1构建的重组载体mRNA抑制率达82%,干扰效率最高,为所需的rBD2基因RNAi慢病毒载体LV-shrBD2.包装慢病毒颗粒并调整病毒滴度至1×105ifu/μl.结论 成功构建并筛选出沉默效应最佳的rBD2基因RNAi慢病毒表达载体LV-sh1rBD2,为进一步开展rBD2研究提供了依据.     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

人神经菌毛素-1基因shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体.方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果.结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109 Tu/mL.转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低.结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体.     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的：通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。 方法： 根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链，插入到pENTR/U6质粒缺口末端，连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体；通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest 载体上,构建含U6启动子、靶序列和Pol Ⅲ终止子表达框的MTCOX-I shRNA表达重组体；经脂质体导入293FT细胞，包装成慢病毒，收集病毒上清并检测其滴度。Western blotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结果： 将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。Western blotting检测结果证实构建的MTCOX-I shRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结论： 成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

Influence of interleukin-1 beta gene polymorphisms on the risk of myocardial infarction and ischemic stroke at young age in vivo and in vitro

In this study, by using vivo and vitro model, we assessed whether interleukin (IL)-1beta gene polymorphisms influence on the risk of myocardial infarction and ischemic stroke at young age. 147 patients (age < 45 years) with a first episode of MI and 56 patients (age < 45 years) with first-ever cerebral ischemia consecutively were admitted to this study from the Department of Chinese PLA General Hospital. Meanwhile, 91 normal volunteers without MI or stroke were deeded as control group and greed to give blood samples for DNA analysis and biochemical measurements by written informed consent. IL-1β-511 wild type (WT, CC) and SNP (TT) were established and transfected into Rat myocardial H9c2 cell and Mouse brain endothelial bEND.3 cells. In Young Age MI or stroke patients, the IL-1β levels of patients with 511CC are higher than that of patients with 511TT. In our study, NF-κB miRNA, iNOS activity, NF-κB, iNOS and Bax protein expressions of MI-induced H9c2 cell or stroke-induced bEND.3 cells in IL-1β-511TT group were lower than those of IL-1β-511CC. Additionally, the protein expression of MMP-2 of MI-induced H9c2 cell or stroke-induced bEND.3 cells in IL-1β-511TT group were higher than that of IL-1β 511CC group. In conclusion, our data indicate that IL-1β-511TT/CC influence on the risk of myocardial infarction and ischemic stroke at young age through NF-κB, iNOS, MMP-2 and Bax.     

截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的构建及表达

目的：构建携带截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因的真核表达载体，并将其在HER2阳性SKBR-3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达。方法：用PCR法获得截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因片段，并克隆构建真核表达载体，以脂质体法转染SKBR-3细胞及Hela细胞，用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响。结果：成功构建了编码截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV-e238Fv-FSD-GrB，用免疫细胞化学检测发现，绝大多数Hela细胞可高表达e23sFv-FSD-GrB蛋白，且细胞形态正常，而表达e23s17v-FSD-GrB蛋白的SKBR-3细胞形态发生变化，出现固缩细胞。结论：截短型转位肽重组抗体／颗粒酶B基因真核表达体系的建立，为确定PE转位肽的最小转位功能区段奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法 将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE／tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论 通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30h和10mmol／L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。     

人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白对HIV-1辅受体抑制作用的研究

目的:在人PBMCs内表达CCR5Delta32蛋白,研究其对细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4的抑制作用。方法:构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测目的蛋白的表达。继续培养靶细胞,FACS分析细胞表面CCR5和CXCR4分子的变化。结果:成功构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒。将其转染PBMCs,Western blot检测到目的蛋白的表达。FACS分析表明,靶细胞内目的蛋白的表达对靶细胞表面辅受体CCR5和CXCR4的产生起抑制作用,抑制率在转染后第6天达到高峰(CCR5的抑制率为51.69%,CXCR4的抑制率为61.05%)。结论:靶细胞内目的蛋白的成功表达及其对靶细胞表面HIV-1辅受体CCR5和CXCR4产生的抑制作用,为后续的AIDS基因治疗研究奠定了基础。