低氧预适应刺激脑海马区内源性神经干细胞的增殖

背景:缺血/缺氧/低氧等刺激均能导致内源性神经干细胞的增殖和分化,起到脑组织修复作用,但低氧预适应能否影响内源性神经干细胞的增殖尚不清楚。目的:探讨低氧预适应对小鼠脑海马区内源性神经干细胞增殖的影响。方法:清洁级Balb/c近交系小鼠随机分为3组,低氧对照组小鼠放入广口瓶内,立即用橡皮塞封紧,以动物出现第1次喘呼吸为低氧耐受极限的标志,完成低氧暴露1次;低氧预适应组小鼠按此法重复操作4次;正常对照组小鼠不进行低氧暴露。通过免疫荧光和激光共聚焦显微镜等技术,测定海马BrdU阳性细胞数和荧光强度。结果与结论:与低氧对照组比较,低氧预适应组小鼠耐受时间显著延长(P0.01)。正常对照组海马区BrdU标记的内源性神经干细胞荧光强度微弱,海马区可见少量BrdU阳性细胞;低氧对照组、低氧预适应组荧光强度及BrdU阳性细胞数均明显增加(P0.01),且低氧预适应组增加幅度大于低氧对照组(P0.01)。证实在低氧预适应过程中,海马区内源性神经干细胞明显增殖,可能参与低氧预适应脑保护机制。     

低氧预适应小鼠脑内ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的改变

目的：初步探讨细胞外信号调节激酶（Extraeellular signal-regulated kinases，ERK1／2）在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法：按已建小鼠整体低氧预适应模型，将BALB／C小鼠（18-22g，雌雄不限）随机分为正常对照（H0）、早期（H1-H4）和延迟性（U5-H6）低氧预适应等7组（每组至少6只动物）。应用SDS-PAGE和Western blot等生化技术，并结合Gel Doc凝胶成像系统，半定量检测小鼠脑组织内ERK1／2的磷酸化水平和蛋白表达量。结果：①早期低氧预适应形成过程中，随低氧暴露次数的增加（H1-H4），小鼠海马和皮层组织内ERK1／2磷酸化水平显著降低（P〈0．05，n=6），而ERK1／2蛋白表达量并无显著变化；②延迟性低氧预适应中（H5-H6），小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1／2的蛋白表达量显著降低（P〈0．05，n=6）。结论：ERK1／2的活性降低（磷酸化水平降低），以及ERK1／2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程。     

低氧预适应对小鼠脑组织内cPKCβI和Βii膜转位水平的影响

目的:通过观察重复性低氧刺激对蛋白激酶CβI和βII亚型(cPKCβI,cPKCβII)膜转位水平(或激活程度)的影响,初步探讨cPKCs特定亚型在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法:按我室已建立的小鼠低氧预适应模型方法,制备重复性低氧1-4次小鼠(H1-H4)。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)等生化技术,并结合应用Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测小鼠海马和大脑皮层组织内cPKCβI和βII的膜转位水平。结果:随低氧刺激次数(H1-H4)的增加,小鼠海马组织内cPKCβII的膜转位水平升高,H4组膜转位水平显著高于H0(100%,n=10)和H1(79·5%±10·7%,n=10)组(173·3%±21·3%,P<0·01,n=10);同样,大脑皮层内cPKCβII膜转位水平也随低氧次数的增加而升高,H3(119·8%±7·7%,n=6)和H4(131·8%±4·7%,n=6)组膜转位水平均显著高于H0(100%,n=6)组(P<0·05,n=6);而cPKCβI亚型的膜转位水平无论在大脑皮层还是海马组织内的变化均不显著(P>0·05,n=8)。结论:cPKCβII膜转位(激活)可能在脑低氧预适应的发生发展过程中发挥着重要作用。     

低氧预适应小鼠脑组织内P38 MAPK磷酸化水平增高

目的探讨P38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)在小鼠脑低氧预适应形成过程中的作用。方法用成年雄性BALB/c小鼠制备小鼠整体低氧预适应模型,小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4)和延迟性(H5～H6)低氧预适应等7组;应用Westernbolt并结合GelDoc凝胶成像系统,定量检测小鼠脑组织内P38MAPK磷酸化水平和蛋白表达量。结果与H0组小鼠相比,H2~H6组的海马和皮层及H3～H6组的下丘脑中P38MAPK磷酸化水平明显增高(P<0·05,每组n=6);H1~H6组的皮层、海马和下丘脑中P38MAPK蛋白表达量无明显变化。结论P38MAPK磷酸化激活而非蛋白表达量的变化可能参与了小鼠脑低氧预适应的发生、发展过程。     

低氧预适应对小鼠海马神经元中TSC1表达的影响

目的:在体视显微镜下分割ICR小鼠海马CA1区和CA3区,研究结节性硬化症因子1(TSC1)在小鼠海马低氧中的神经保护作用。方法:ICR小鼠分为对照组(control)、低氧对照组(hypoxia)及低氧预适应组(HPC),在体视显微镜下观察海马形态并分割CA1区和CA3区;采用real time RT-PCR和Western Blot的方法分别检测小鼠海马组织TSC1 mRNA和蛋白的表达;采用免疫荧光检测小鼠海马组织TSC1荧光强度。结果:大脑冠状切片清晰显示出海马CA1区、CA3区和DG区;CA1区TSC1 mRNA在低氧组降低而在低氧预适应组增高;Western Blot和组织免疫荧光显示:与对照组相比,低氧预适应组CA1区TSC1表达增加;而CA3区TSC1在低氧组和低氧预适应组均增加。结论:TSC1的差异性表达可能提示TSC1可能参与了低氧预适应对低氧敏感的CA1区神经细胞的保护。     

低氧预适应小鼠脑组织内CaMKⅡ磷酸化水平增高

目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)在小鼠脑低氧预适应(HPC)发生发展中的作用。方法成年雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1～H4)和延迟性(H5～H6)低氧预适应等共计7组,制备小鼠HPC模型;用Western blot并结合GelDoc凝胶成像系统,检测小鼠脑组织内CaMKⅡ磷酸化水平和蛋白表达量;用免疫组化检测小鼠脑皮层和海马CaMKⅡ磷酸化水平。结果与H0组小鼠相比,H3～H5组海马和皮层的CaMKⅡ磷酸化水平明显升高(P<0.05);而H1～H6组的皮层和海马的CaMKⅡ蛋白表达量无明显变化;H3、H6组皮层和海马p-CaMKⅡ阳性细胞数目增多和灰度增强。结论CaMKⅡ磷酸化水平的升高可能参与了小鼠脑HPC的发生发展过程。     

低氧预适应升高小鼠脑内JNK磷酸化水平和蛋白表达

目的探讨C-JUN氨基末端激酶或应激激活蛋白激酶(JNKs/SAPKs)在脑低氧预适应发生、发展过程中的作用。方法将小鼠整体低氧预适应模型中BALB/C小鼠随机分为正常对照(H0)、早期(H1~H4组)和延迟性(H5~H6组)低氧预适应等7组。应用SDS-PAGE和Western bolt方法,并结合Gel Doc凝胶成像系统,半定量检测大脑皮层和海马组织内JNK1和JNK2/3的磷酸化水平及其蛋白表达量的变化。结果在早期低氧预适应形成过程中,随低氧次数的增加,小鼠大脑皮层和海马组织内JNK1的磷酸化水平(未检测到磷酸化的JNK2/3)逐渐升高,且以皮层内(H1和H2组)和海马组织内(H1~H4组)的增高明显(P<0.05,n=6);而JNK1和JNK2/3只在延迟性低氧预适应(H5~H6组)发展过程中明显上调(P<0.05,n=6)。结论JNK1的激活以及JNK1和JNK2/3蛋白表达量的增高可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生和发展。     

人脐带间充质干细胞移植对慢性应激模型小鼠抑郁行为的改善作用

目的 探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）尾静脉移植对慢性不可预测性温和应激（CUMS）模型小鼠抑郁行为的改善作用。 方法 获得第3代hUCMSCs；将60只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组（给予生理盐水）、细胞组（移植hUCMSCs）、氟西汀（flu）给药组（给予flu），每组15只。构建6周CUMS小鼠抑郁模型；从第3周开始将hUCMSCs、生理盐水以尾静脉注射的方式移植给小鼠；从第5周开始每天给予小鼠flu灌胃；记录各组小鼠每周的体重变化；通过蔗糖偏好实验、悬尾实验、强迫游泳实验及旷场实验评估小鼠抑郁模型及治疗效果；HE染色观察海马CA1及CA3区细胞变化；透射电子显微镜检测海马CA3区突触的超微结构变化；Real-time PCR检测海马突触可塑性关键蛋白突触素（SYP）和突触后致密物95（PSD-95）的mRNA表达情况。 结果 hUCMSCs可以改善因CUMS导致的小鼠体重下降；行为学实验观察到，模型组小鼠出现抑郁行为，细胞组和给药组小鼠抑郁行为得到改善；HE染色观察到，与模型组相比，细胞组和给药组小鼠海马CA1及CA3区细胞排列整齐，数量增多；透射电子显微镜观察到，与模型组相比，细胞组和给药组海马CA3区亚细胞结构突触数量更多，突触间隙更窄，突触棘密度更大；Real-time PCR检测到，细胞组和给药组比模型组SYP和PSD-95的mRNA表达更多。 结论 hUCMSCs移植具有抗抑郁作用，这种作用与改善海马的突触可塑性有关。     

重复性低氧增高小鼠脑组织内CREB的磷酸化水平

为探讨cAMP反应元件结合蛋白(CREB)在小鼠脑低氧预适应形成过程中的作用,本研究应用Westernblot技术结合GelDoc凝胶成像系统,半定量检测了整体低氧预适应模型小鼠脑组织内CREB的磷酸化水平和非磷酸化水平的表达水平。结果显示:(1)随低氧暴露次数(H1H4)的增加,小鼠海马组织内CREB的磷酸化水平(激活程度)明显增高(P<0.05;n=7);同样,大脑皮层内CREB的磷酸化水平也随低氧暴露次数(H1H4)的增加而明显增高(P<0.05,n=7);(2)随低氧暴露次数(H1H4)的增加,CREB的蛋白表达量无论在小鼠海马组织还是皮层组织内均无明显变化。以上结果提示CREB磷酸化水平的增高(激活)可能参与了脑低氧预适应的形成过程。     

雷公藤甲素抑制APP/PS1双转基因AD模型小鼠海马内Aβ沉积和老年斑形成

目的 研究雷公藤甲素(T10)对APP/PS1双转基因AD模型小鼠(APP/PS1dtg)β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积与老年斑(SP)形成的影响。 方法 取18只45月龄健康雄性APP/PS1dtg, 随机分为3组,分别以T10灌胃：5μg/(kg&#8226;d) (T10 H组)、1μg/(kg&#8226;d) (T10 L组)和等容量的溶媒灌胃（PLC组）,共计45d。45d后取材,左侧半大脑切片,6E10免疫组织化学方法染色和刚果红染色结合无偏性体视学定量分析,研究T10对海马Aβ沉积和SP形成的影响;分离右侧半海马,免疫印迹法分析海马Aβ蛋白水平的变化。 结果 与PLC组比较, T10 H组海马6E10阳性的Aβ沉积总面积减少了35％(P<0.001),SP总面积减少了32％(P<0.001); T10 L组海马Aβ斑总面积减少了18％(P<0.05), SP总面积减了21％(P<0.05); T10呈剂量依赖性抑制Aβ在APP/PS1dtg 海马的沉积和SP的形成,减少海马内Aβ蛋白水平; 免疫印迹分析也显示,T10 H组海马Aβ蛋白水平最低,PLC组Aβ蛋白水平最高,T10 L组Aβ蛋白水平介于两者之间。     

双氢睾酮对快速老化小鼠海马CA1区突触可塑性和N-甲基-D-天冬氨酸受体1的影响

目的 探讨双氢睾酮(DHT)对快速老化小鼠(SAMP8)海马CA1区突触可塑性和N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NMDAR1)的影响.方法 6月龄雄性SAMP8小鼠21只随机分为假手术组、去势组及去势+DHT补充治疗组,每组7只.DHT剂量为1mg/(kg·d),皮下注射21d后,通过Golgi染色观察海马CA1区顶树突树突棘的变化;免疫组织化学及图像分析检测突触素和NMDAR1表达的改变.结果 1.Golgi染色,去势组海马CA1区顶树突树突棘个数明显减少;DHT补充治疗后,树突棘个数明显增多.2.去势组海马CA1区突触素和NMDAR1的表达明显减少,平均吸光度值明显低于其他组(P<0.05).DHT补充治疗能明显增加突触素和NMDAR1的表达.结论 DHT可调节海马CA1区突触可塑性,使树突棘密度增多.DHT对突触可塑性的影响可能与其调节锥体细胞的NMDAR1有关.     

Chronic restraint stress induces changes in synapse morphology in stratum lacunosum-moleculare CA1 rat hippocampus: a stereological and three-dimensional ultrastructural study

Chronic restraint stress is known to affect the morphology and synaptic organization of the hippocampus, predominantly within CA3 but also in CA1 and dentate gyrus. In this study, we provide the first evidence for specific ultrastructural alterations affecting asymmetric axo-spinous synapses in CA1 stratum lacunosum-moleculare following chronic restraint stress (6 h/day, 21 days) in the rat. The structure of asymmetric axo-spinous post-synaptic densities was investigated using serial section three-dimensional reconstruction procedures in control (n=4) and chronic restraint stress (n=3) animals. Dendritic spine profiles (spine head+neck) associated with the sampled synaptic contacts (30 per animal) were also reconstructed in three-dimensions. Morphometric analyses revealed a significant increase in post-synaptic density surface area (+36%; P=0.03) and a highly significant increase in post-synaptic density volume (+79%; P=0.003) in the chronic restraint stress group. These changes were directly associated with 'non-macular' (perforated, complex and segmented) post-synaptic densities. A highly significant overall increase in the 'post-synaptic density surface area/spine surface area' ratio was also detected in the chronic restraint stress group (+27%; P=0.002). In contrast, no quantitative changes in spine parameters were found between groups. The Cavalieri method was used to assess the effects of chronic restraint stress exposure upon CA1 hippocampal volume. The mean volume of total dorsal anterior CA1 hippocampus was significantly lower in the chronic restraint stress group (-16%; P=0.036). However, when corrected for volume changes, no significant alteration in a relative estimate of the mean number of asymmetric axo-spinous synapses was detected in CA1 stratum lacunosum-moleculare between control and chronic restraint stress groups. The data indicate a structural remodeling of excitatory axo-spinous synaptic connectivity in rat CA1 stratum lacunosum-moleculare as a result of chronic restraint stress.     

胰岛素样生长因子1在新生大鼠短暂脑缺血损伤修复中的关键作用

目的7日龄新生大鼠短暂脑缺血诱导侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞增殖,观察胰岛素样生长因子1（IGF-1）对神经干细胞增殖的影响。方法 7日龄新生SD大鼠64只,随机分为缺血组（n =24）、假手术组（n =24）、缺血阻断剂组（n =8）和缺血生理盐水组（n=8）。利用免疫组织化学方法观察缺血组和假手术组在缺血后1、4、7d SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化,并观察缺血阻断剂组和缺血生理盐水组在IGF-1受体阻断剂（JB1）阻断7d后SVZ新生细胞数量和IGF-1表达的变化。结果 与同时间点假手术组比较,缺血后1、4、7d的SVZ新生细胞和IGF-1阳性细胞数量均显著增加,差异有统计学意义（P ＜0.05）;使用JB1后,缺血阻断剂组IGF-1的表达被阻断,IGF-1阳性细胞缺如,而缺血生理盐水组IGF-1表达正常;使用JB1后,缺血阻断剂组SVZ新生细胞数量显著减少,与缺血生理盐水组相比,差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 新生大鼠缺血再灌注损伤上调了IGF-1的表达,IGF-1表达增加促使SVZ神经干细胞增殖;使用JB1后,IGF-1的表达被阻断,神经干细胞增殖也显著减少,提示IGF-1在脑缺血损伤修复中起关键作用。     

海马CA1区穿孔突触数与联合学习成绩优良相关性

目的：研究联合学习是否伴有海马内突触的形态学变化。方法：对小鼠进行行为训练(联合学习)，然后根据成绩分绩优组和绩低组。取海马CA1区辐射层作超薄切片，电镜观察，并定量研究单位切片面积内的突触数。结果：与对照组相比，绩优组的穿孔突触数显著增加了2倍，而绩低组无显著变化。结论：小鼠海马CA1区的穿孔突触增多是联合学习成绩优良的重要形态基础。     

β-catenin在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化过程中的定位、表达及意义

目的 探讨肝纤维化发生过程中β-连环蛋白(β-catenin)定位、表达及意义.方法 健康雄性昆明小鼠(n=45)随机分为对照组(n=15)与实验组(n=30).实验组小鼠皮下注射50% 四氯化碳(CCl4)-粟米油混合液(6ml/kg),2次∕周,对照组皮下注射同等剂量的粟米油.各组分别于造模1周、4周和8周后取小鼠肝脏,常规制作石蜡切片,Masson染色及Desmin免疫组织化学法观察比较不同组别小鼠肝纤维化病理变化,RT-PCR及免疫组织化学方法检测不同时间点各组小鼠肝组织内β-catenin的表达及定位.结果 Masson染色结果显示,对照组肝汇管区结缔组织内及血管壁有少量细小纤维,实验组小鼠肝脏汇管区和中央静脉及其周围胶原纤维增多;随损伤时间延长纤维增生愈加明显.Desmin免疫组织化学结果显示,各组别均有阳性表达,但损伤组各时间点desmin阳性表达细胞数明显高于对照组(P<0.05 或P<0.001).RT-PCR结果显示,CCl4损伤1周后肝内β-catenin mRNA水平与对照组相比无明显差别(P＞0.05),损伤4周及8周β-catenin mRNA水平则明显下降,与对照组相比差异均有显著性(P<0.01).免疫组织化学结果显示,对照组β-catenin弱表达于肝细胞膜及胆管上皮细胞膜和胞质,而损伤组β-catenin阳性反应主要定位于肝内增生的细胞团及新生胆管上皮细胞质,各组间积分吸光度值差别有显著性(P<0.01).结论 CCl4诱导的肝纤维化过程中β-catenin mRNA表达与蛋白表达不同步,阳性表达细胞主要为新生的细胞团及胆管上皮细胞.     

Ghrelin对小鼠空间记忆和海马神经元突触及生长激素促分泌素受体表达的影响

目的 探讨Ghrelin对正常小鼠空间学习记忆能力和海马神经元突触及生长激素促分泌素受体（GHS-R）表达的影响。方法 8周龄小鼠 20只,随机分为实验组和对照组,分别腹腔注射Ghrelin和等量生理盐水,通过水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力,免疫组织化学实验检测海马Ghrelin受体GHS-R表达,并通过电子显微镜观察海马突触的超微结构变化。结果 水迷宫隐匿平台实验中,第2、3、4天,实验组小鼠的逃避潜伏期与对照组相比明显缩短（P <0.05）,跨越平台次数明显增加(P <0.05）,海马CA3和齿状回区GHS-R免疫阳性产物表达明显增强（P <0.05）,神经元突触数量明显增加（P <0.05）。结论 Ghrelin可能通过结合GHS-R,增加海马神经元突触数量,显著改善小鼠的空间学习记忆能力。     

己酮可可碱抑制大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝细胞的凋亡

目的 探讨凋亡相关基因在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发生发展中的作用机制,以及己酮可可碱(PTX)对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠的抗凋亡作用. 方法 SD大鼠68只,标准饲料喂养1周后,随机分为8组:8周对照组(6只),8周模型组(10只),12周对照组(6只),12周模型组(10只),12周治疗组(10只),16周对照组(6只),16周模型组(10只),16周治疗组(10只).用高脂饮食法建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型,腹主动脉取血检测血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氮酶(AST)水平,采用免疫组织化学的方法检测肝Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达情况,应用RT-PCR检测Caspase-3 mRNA的转录情况. 结果 各模型组ALT、AST均高于对照组,且模型组的ALT、AST逐渐增高.免疫组织化学实验结果表明,与同周数的对照组相比,各周模型组Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达均有显著性增加(P<0.05),与同周数的模型组相比,12周、16周PTX治疗组Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达有显著的降低(P<0.05). 结论 细胞凋亡是NASH的一个重要发病机制,己酮可可碱对NASH大鼠肝脏细胞凋亡有一定的抑制作用.     

大鼠冻存卵巢组织自体异位移植后长期功能评估

目的 评估成年大鼠冻存卵巢组织自体异位移植后的长期生殖、内分泌功能. 方法 78只Wistar成年大鼠,随机分为假手术组(1组,15只)、新鲜组织移植组(2组,24只)、冻存组织移植组(3组,24只)、去势组(4组,15只).将去势后成年大鼠的新鲜卵巢组织及冻存卵巢组织自体异位移植于肾被膜下,分别于移植后5、8、10个月处死各处理组1/3数量动物,取卵巢及子宫组织作组织学检查.通过阴道脱落细胞学检查、动情期雌、孕激素水平监测评估移植后卵巢组织的生殖内分泌功能. 结果 所有动物模型中,新鲜及冻存卵巢组织移植后都可观察到存活组织块.2、3组动情期雌、孕激素水平与假手术组无显著性差异(P>0.05),且均明显高于去势组(P<0.01).冷冻复苏后组织与新鲜组织各级卵泡构成比无显著性差异(P>0.05),各组不同时间取得的卵巢组织各级卵泡构成比相比较均无显著性差异(P>0.05).移植后5个月,2、3组原始卵泡明显减少,分别为假手术组的59.1%和54.5%. 结论 小块卵巢组织可耐受冻融过程;冻存卵巢组织自体肾被膜下移植后,卵巢组织形态无明显改变,原始卵泡总数虽然明显减少,但有成熟卵泡发育并排卵,并能长期维持生殖内分泌功能.     

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在大鼠生后海马发育中的表达

目的 探讨Wistar大鼠生后海马发育过程中钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的表达。 方法 应用免疫荧光方法检测CaMKⅡ在生后不同时期大鼠海马CA1、CA3区和齿状回（DG）中的表达情况（n =48）。结果 CaMKⅡ于生后各期海马CA1区和DG的表达逐渐增强，生后第10天（P10）达高峰期，此后逐渐减弱；于CA3区的表达在P4和P10时均较高。其中，CaMKⅡ在CA3区的表达高于在CA1区和DG的表达，在多形层和分子层的表达高于在锥体细胞层或颗粒细胞层的表达。结论 CaMKⅡ在CA1、CA3区和DG中的表达具有特异性的时空分布模式，这可能与其在生后发育过程中的突触发生，树突、轴突形成，海马的成熟以及学习记忆功能相关。