骨髓基质细胞复合人脱细胞骨的成骨活性

背景：寻找一种既保持支持功能良好又具有一定成骨活性的同种异体骨是治疗骨缺损的重要研究课题。以往曾对比测定脱细胞骨的生物力学性质，发现其与正常大小的新鲜骨质在最大抗压力，压强方面无显著性差异。人脱细胞骨复合骨髓基质细胞后的成骨活性如何，是否能够保持成骨的活性是临床医生非常关心的问题。目的：研究人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞的实验效果，观察细胞的黏附和生长情况，并对其成骨活性进行检测。设计：单一样本实验。单位：哈尔滨医科大学附属第二医院。材料：实验于2003—01／2004—08在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成。脱细胞骨（取新鲜尸体髂骨块，自愿捐献）。方法：用过氧化氢和乙醚去除人髂骨块内的结缔组织和细胞成分，消毒后制备人脱细胞骨。取材活体或新鲜尸体的骨髓行骨髓基质细胞培养，细胞纯化后加入β-甘油酸钠，地塞米松和抗坏血酸等向成骨方向诱导，并进行对照培养。通过碱性磷酸酶和骨钙素检测来确定骨髓基质细胞的增殖和分化情况，将诱导的骨髓基质细胞浓缩后复合到制备好的脱细胞骨块内进行培养。8d后通过光镜和电镜等形态学观察以及生化指标检测来确定细胞的成骨活性。主要观察指标：①人骨髓基质细胞／脱细胞骨复合物碱性磷酸酶和骨钙素检测结果。②人骨髓基质细胞／脱细胞骨复合物组织学观察结果。结果：①人髂骨块细胞清除干净，骨基质保存良好。②诱导8d后的骨髓基质细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量明显高于对照组[诱导后骨髓基质细胞：（181．54&;#177;40．01）nkat／L，（7．2&;#177;1．3）μg/L，对照组：无法测到，P〈0．05]。③骨髓基质细胞在人脱细胞骨支架内附着紧密，生长良好。结论：人脱细胞骨复合经诱导的骨髓基质细胞在体外具有有效的成骨功能，是一种较为理想的骨组织工程材料。     

磷酸钙骨水泥／骨形态蛋白人工骨复合骨髓基质细胞构建组织工程骨

背景:体外实验证明磷酸钙骨水泥/骨形态蛋白人工骨具有较强的骨诱导作用,但足磷酸钙骨水泥/骨形态蛋白人工骨能否作为骨髓基质细胞的生长支架报道较少.目的:验证磷酸钙骨水泥/骨形态蛋白人工骨做为骨组织工程支架材料的可行性.设计、时间及地点:观察实验,于2008 03/2009-03在上海市第九人民医院口腔组织工程实验室完成.材料:磷酸钙骨水泥/骨形态蛋白人工骨产品由瑞邦公司提供,大孔径200～500μm,小孔径1～5μ m,孔隙率为70%.两岁的健康毕格犬1只.方法:抽取成年毕格犬的骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况.将培养的第2代细胞接种于多孔型活性磷酸钙骨水泥,进行超微结构观察,并将多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物植入毕格犬背部皮下,2,4周后进行组织学检测.主要观察指标:倒置相差纤维镜下观察细胞的生长、增殖情况;碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、骨钙素免疫细胞化学染色鉴定骨细胞的形成标志:扫描电镜观察细胞材料复合情况;苏木精-伊红染色观察体内异位成骨情况.结果:碱性磷酸酶染色呈阳性;Von Kossa染色可见钙结节形成;骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示4周时复合物内有新骨形成.结论:多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,磷酸钙骨水泥/骨形态蛋白人工骨可以用于骨组织工程支架材料.     

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的:观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法:比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性,观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平,并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.01),诱导培养最高;经过诱导培养及共培养的间充质细胞,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点,诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

两种方法诱导骨髓基质细胞向成骨表型分化的比较

目的探讨骨髓基质细胞分化为成骨表型的诱导条件。方法体外扩增大鼠骨髓基质细胞,将第3代细胞分为A组(对照组)、B组(加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、1,25-二羟维生素D3的诱导组)和C组(在B组基础上加大鼠长骨骨折血肿浸出液诱导组),于诱导后第5、8、11天观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测诱导细胞的成骨样细胞标志分子(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素),并用von Kossa法检测培养物钙化情况。结果诱导大鼠骨髓基质细胞经小分子诱导培养5d后,部分发生形态学变化,碱性磷酸酶和I型胶原呈弱阳性表达,无钙质沉积;诱导8d后,发生形态学变化的细胞增多,呈集落生长,碱性磷酸酶和I型胶原表达增强,钙质沉积仍不明显;11d后,骨钙素开始表达,且出现钙质沉积。C组细胞表型变化与B组类似,但发生变化的细胞和钙质沉积的数量更多。结论骨髓基质细胞在体外可以被小分子物质诱导为成骨表型;骨折血肿浸出液能够加强这一作用,可作为一种诱导成骨的添加成分。     

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的：观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法：比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性，观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平，并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果：共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P&lt;0．01)，诱导培养最高；经过诱导培养及共培养的间充质细胞，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论：诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点，诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

BMP6对小鼠骨髓基质细胞定向成骨分化的影响

目的初步研究BMP6对小鼠骨髓基质细胞定向成骨分化的影响,探讨其作为定向诱导细胞成骨分化细胞因子的可能性。方法BMP6腺病毒感染骨髓基质细胞（BMSC）。染色和定量检测碱性磷酸酶（ALP）的表达;实时荧光定量聚合酶链反应检测骨桥素（OPN）和骨钙素（OC）的表达;荧光素酶报告基因实验检测BMP6对于转录因子Smad和成骨关键基因Runx2的活化作用。结果BMP6能诱导BMSC细胞ALP的表达,且具有剂量依赖性;BMP6刺激后,BMSC细胞晚期成骨基因OPN、OC的表达均有明显的增加;BMP6可以活化Smad和成骨关键基因Runx2。结论BMP6可以促进小鼠骨髓基质细胞定向成骨分化。     

体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

背景:目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织,近年来的研究多集中于骨髓基质细胞.而脂肪中基质细胞的发现,有望取代骨髓基质细胞.目的:观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性,并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性,从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞.方法:手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织.脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞,骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞;体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养.诱导后第2,3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性,并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞.结果与结论:共获得15例患者的脂肪与骨髓组织,其中10例完成实验.与骨髓基质细胞相比,脂肪基质细胞更易培养成活,扩增速度快;二者细胞形态相似,诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成;碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05).结果提示脂肪组织来源丰富,脂肪基质细胞成活容易,具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能,且易培养、增殖快,二者的成骨活性相似,脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势.     

间充质细胞与骨组织共培养条件下的成骨特性

目的:在与骨组织间接共培养的条件下,观察体外培养的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法:通过间接共培养模型的建立,将新鲜兔骨碎粒及骨块与BMSCs间接共培养,观察细胞的形态学变化、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力,免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养的BMSCs同期ALP活性及细胞的矿化能力均显著高于普通培养组(P<0.01);经过共培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:体外建立的共培养模型部分模拟了体内成骨环境,经过共培养的BMSCs呈现向成骨细胞转化的特点。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

兔骨髓基质细胞的体外分离培养及诱导成骨的实验研究

目的 探讨兔骨髓基质细胞（BMSCs）的体外分离培养及定向诱导成骨的方法。方法 选择10周龄新西兰兔，抽取其股骨大转子部骨髓，体外分离纯化得到BMSCs，再利用条件培养液将其向成骨方向定向诱导培养。采用碱性磷酸酶（ALP）和冯库萨（Von Kossa）染色方法，鉴定其成骨性能。结果 BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖，经ALP和Yon Kossa染色证实其有成骨潜能。结论 兔BMSCs的体外培养增殖能力强，能诱导分化为成骨细胞，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

富血小板血浆及带血管筋膜在组织工程骨血管化中的作用组织影像学观察

背景：富血小板血浆中的多种生长因子及带血管筋膜是否具有促进骨再生及血管化作用尚在争论之中。目的：拟从组织影像学角度评价富血小扳血浆及带血管筋膜对骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合的组织工程骨血管化作用效果。设计、时间及地点：单一样本观察及动物同体对照实验，于200410／200711在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：1-12月龄健康杂种犬12只，体质量20～25妇，雌雄各半。方法：④采用密度梯度离心法从犬骨髓中分离骨髓基质干细胞，体外贴壁培养扩增、成骨诱导培养。取杂种犬的股骨制备脱钙骨基质，并与骨髓基质干细胞复合。②将每只犬的背部分为4个区，A，B区，植入加富血小板血浆的骨髓基质干细胞，脱钙骨基质复合体，C，D区，仅植入骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合体。A，C区植入物用背阔肌带血管肌筋膜包囊；B，D区植入物用背部不带血管的浅筋膜包裹。分别在4，8，12周各取4只，雌雄各半，麻醉后处死取标本。主要观察指标：④采用倒置相差显微镜观察骨髓基质干细胞形态，四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线。②行改良钙钴法碱性磷酸酶染色，VonKossa法、茜素红法，钙结节染色观察诱导成骨细胞形态特征。③应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察复合体的结构。④行大体标本、X射线数字影像及组织学观察评价。结果：①诱导成骨分化的骨髓基质干细胞分泌的碱性磷酸酶及钙结节染色均呈阳性。②骨髓基质干细胞和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。⑨同种异体脱钙骨基质与骨髓基质干细胞复合培养后，细胞上架率高，生长状态好，增殖迅速，能分泌大量细胞外基质。④各时间点A，B，C区在成骨的骨量、骨光学密度、血管化程度等方面均明显优于D组（P〈0．05）。结论：经组织影像学观察证实，富血小板血浆和带血管肌筋膜均能促进组织工程骨的成骨和血管化，且两者具有协同作用。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标主要结局①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592±86.567)nkat/L与转染空载体(155.231±86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866±91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.     

地塞米松诱导联合骨形成蛋白2基因修饰兔骨髓间质干细胞的成骨转化

背景:骨髓间质干细胞在地塞米松等骨诱导剂的作用下能够向成骨细胞分化;同时骨形成蛋白2在骨修复过程中促进细胞增殖分化和基质分泌,在体内外均可诱导骨形成,以上二者联合应用可能会产生一定的协同效应.目的:分析体外经地塞米松诱导是否能增强骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞的成骨转化能力.设计:随机化配对设计.单位:解放军第四军医大学西京医院.材料:实验于2004-02/2004-08在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所完成.选用2月龄新西兰白兔20只,由解放军第四军医大学实验动物中心提供(许可证号:军动管字第2005C00117号).室温、常湿,正常喂食.双侧取材,左侧肢体来源骨髓间质干细胞为地塞米松诱导组,右侧为对照组(未经诱导).方法:将地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞分别转导含有人骨形成蛋白2基因的复制缺陷重组腺病毒Ad-BMP-2后,以反转录-聚合酶链反应和免疫组化方法检测细胞中骨形成蛋白2的表达情况.观察骨髓间质干细胞的生长情况,并应用碱性磷酸酶检测试剂盒及骨钙素放免试剂盒测定Ad-BMP-2转导5 d后两组骨髓间质干细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.主要观察指标:①骨髓间质干细胞中骨形成蛋白2的表达情况.②骨髓间质干细胞的形态学变化.③骨髓间质干细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量.结果:①转导后骨形成蛋白2基因在地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞中均有表达.②骨髓间质干细胞经地塞米松成骨诱导后形态较不规则,呈三角形、多角形改变,较基础培养基培养细胞生长缓慢.基因转导后细胞形态无明显改变.③转基因5 d后,地塞米松诱导组骨髓间质干细胞培养上清中碱性磷酸酶活性高于对照组[(134.36±8.84,104.02±7.83) nkat/L(t =3.350 6,P＜0.01,n =20)];地塞米松诱导组骨髓间质干细胞骨钙素分泌量高于对照组[(14.68±0.73,6.52±1.21) μg/L(t =3.568 2,P＜0.01,n =20)].结论:转基因前的地塞米松诱导能够促进骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞增殖和成骨转化.     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓基质细胞与聚己内酯的生物相容性

背景:骨缺损修复一直是骨科领域的难题之一,近年来,组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复提供了全新的思路和方法,而生物材料的生物相容性检测是其中重要的一个环节。目的:探讨骨髓基质细胞与聚己内酯的生物相容性。设计:对照观察。单位:新疆医科大学第一附属医院骨科。材料:实验于新疆医科大学第一附属医院骨科实验室完成。选4～8周龄健康新西兰大白兔,体质量2kg左右。方法:①抽吸双侧股骨骨髓并混入RPMI1640完全培养基进行细胞培养,然后进入传代培养。②进行细胞接种并分为聚己内酯组及对照组,对照组单纯接种细胞,聚己内酯组将骨髓基质细胞与聚己内酯体外复合培养,进行形态学观察、细胞增殖、蛋白质含量及酶学测定。主要观察指标:骨髓基质细胞生长及与聚乙内酯生物材料附着情况。结果:对照组细胞多向梭形细胞或多角形细胞转化。聚己内酯组骨髓基质细胞能在聚己内酯上贴附、繁殖,其生长及功能不受影响,并且聚己内酯具有一定的促细胞增殖作用。结论:聚己内酯具有良好的细胞相容性,有可能作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的研究。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.     

人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化.目的应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化.设计单一样本观察.单位中山大学附属第一医院骨科. 材料pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒.方法实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成.全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型.主要观察指标①兔骨髓基质干细胞的形态及生长.②表达产物的鉴定.③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果.④茜素红染色结果.⑤透射电镜观察结果.⑥扫描电镜观察结果.⑦骨钙素的测定结果.结果人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化.骨钙素表达较未转染组明显增强.转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性.结论人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化.