蛋白激酶C亚型在小鼠胚胎干细胞中的表达研究

[目的]研究5种蛋白激酶C(PKC)亚型PKC_α、PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)株ES-BALB/c的表达情况。[方法]ES-BALB/c细胞株用普通ES细胞培养液培养,分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,培养2d和4d后分别进行PKC亚型免疫组织化学和Western印迹检测。[结果]免疫组化发现PKC_α在ES-BALB/c细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞核最甚,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无明显表达;Western印迹发现PKC_α出现一条蛋白印迹条带,分子质量约为84ku,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型无蛋白印迹条带。[结论]PKC_α在ES细胞阶段即有表达,在将来的细胞分化阶段可能有非常重要的作用,而PKC_β、PKC_γ、PKC_δ和PKC_ε4种亚型在ES细胞阶段没有表达。     

KBV2000细胞多药耐药蛋白激酶C亚型表达的关系

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC）亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的关系。方法 （1）用Western blotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布；（2）流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果 （1）PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高，而PKCβ、ε无显著变化，PKCγ、ζ则未测出表达；（2）流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高，PKCβ、ε则无显著差别。结论 PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中，PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

胃泌素对人胃癌细胞BGC-823生长的影响和受体后信息传递

目的：观察胃泌素对人低分化胃癌细胞株BGC-823的生长调控作用，测定细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量、蛋白激酶c（PKC）活性及PKC亚型的表达，探讨受体后信息传导途径。方法：应用MTT法观察细胞的增殖程度，放射免疫分析方法测定细胞内cAMP含量，[γ-^32P]ATP掺入外源性底物的方砖测定PKC活性，Western blot方法分析PKC亚型α，β1,β2及ε的表达。结果：胃泌素能促进BGC-823细胞的生长。且与剂量呈正相关（r=0．74，P〈0．05）；这种促生长作用被胃泌素受体拮抗剂丙谷胺拮抗。胃泌素能促进细胞PKC活性的增加，cAMP含量无明显变化；胃泌素使PKCα表达明显增加，PKCβ1、PKCβ2及PKCε无明显表达。结论：胃泌素促进胃癌细胞BGC-823生长的作用由相应的受体介导，其受体后信息传递途径可能涉及二酯酰甘油蛋白激酶C系统，PKCα在胃泌素的受体后信息传递中起重要作用。     

肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化及其意义

目的 探讨肿胀激活状态下，传统型蛋白激酶C（cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达，亚细胞分布变化及其意义。方法 采用免疫荧光及免疫印迹方法，观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化，利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与-P-糖蛋白（Pgp)的共表达。结果 在正常状态下，cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SCG7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达：PKCα在耐药细胞表达呈强阳恬药敏细胞表达呈强阳性，PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均呈强阳性。持续低渗灌流，在耐药系10min已发现有PKCα、PKCγ的移位及细胞体积的增大；30minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；60min时PKCα及PKCγ基本恢复至正常位置。细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα及PKCγ几乎全部一笔勾销 位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积也恢复正常；在药敏细胞系10-20minPKCα几乎全部移位至细胞膜上，PKCγ部分移位至细胞核内，细胞体积较前增大1-2倍；40minPKCα及PKCγ基本恢复至正常位置，细胞体积也恢复正常，而PKCβ1及PKCβα在耐药细胞及药敏细胞的亚细胞分布无明显变化。共聚焦显微镜提示PKCα及PKCγ同工酶亚型参与了Pgp与低渗刺激下细胞共表达，以耐药细胞表达明显。结论 只有PKCα及Pgp表达量有关，而PKCβ1及PKCβⅡ可能与这一过程无关。βββ     

胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性

目的 观察传统型蛋白激酶C（cPKCs）在胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR1.0、耐药亚系SGC7901／VCR0.3,7901/0.7及药敏细胞系SGC7901表达及活性的变化,以及对细胞内药物浓度的影响。方法 用免疫荧光化学及蛋白印迹方法观察传统型蛋白激酶C在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系的表达;竞争蛋白结合法测定PKC的活性;应用流式细胞仪观察细胞内药物浓度的变化。结果 PKCα,PKCβⅠ,PKCβⅡ及PKCγ在胃癌耐药细胞系及药敏细胞系均有表达,PKCα在耐药细胞表达呈强阳性,在药敏细胞表达呈阳性;PCKβⅠ及PKCβⅡ在耐药细胞及药敏细胞表达均为阳性;PKCγ在耐药细胞及药敏细胞表达均为强阳性。免疫蛋白印迹实验证实,随耐药指数的增加,PKCα表达呈逐渐增高的趋势,薄层扫描蛋白印迹带的吸光度（A）分别为9584.17,9421.06,8534.64,8088.79,而PKCβⅠ、PKCβⅡ及PKCγ在耐药细胞系、耐药亚系及其药敏细胞系表达无明显变化。PKC活性检测结果提示,随耐药指数的增加,PKC活性呈逐渐增高的趋势,以细胞质及细胞核的PKC活性增高为主。结论 传统型蛋白激酶C在维持胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR的多药耐药中起重要作用且具有同工酶特异性。     

蛋白激酶C在人骨肉瘤细胞多药耐药中的作用及机制

目的 研究蛋白激酶C(PKC)主要亚型在入骨肉瘤143B细胞中的表达情况及其与143B细胞耐药的关系。方法采用Western blot法检测PKC主要亚型α、β和γ磷酸化形式p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCβγ和多药耐药蛋白-1(mutidrug resistance protein-1,MDR-1)在人骨肉瘤1...     

人心房肌蛋白激酶C表达下调参与心房颤动发病机制

目的：研究心房颤动（atrial fibrillation, AF）时心房肌组织中PKCα、δ、ε、θ4种亚型mRNA和PKC总蛋白的表达变化,探讨PKC与AF发生发展的相关性。方法：泸州医学院附属医院行体外循环手术患者常规切除的右心耳组织作为研究对象。①实时定量PCR实验：提取人右心耳组织总RNA,β-actin为内参照基因,采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR技术检测SR和AF患者PKCα、δ、ε、θ基因mRNA水平。②western blotting实验：右心耳组织提取总蛋白,测定蛋白浓度,GAPDH作为内参照,SDS-PAGE电泳检测SR和AF患者PKC的蛋白表达变化。结果：①AF患者心房肌细胞PKCα和PKCδ亚基mRNA水平下调;PKCε和PKCθ亚基mRNA水平明显上调。②SR组与AF组PKC总蛋白相对表达量分别为1.37±0.09（n=23）、1.00±0.10（n=18）,（P〈0.05）有统计学意义。结论：与SR患者相比,AF患者心肌细胞中PKCα、δ亚基mRNA明显下调,PKCε、θ亚基mRNA上调,PKC总蛋白表达降低。 PKC亚型mRNA和总蛋白的表达变化可能是参与AF发生发展的分子基础之一。     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C亚型表达的关系

目的探讨蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)亚型与KBV200肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance,MDR)的关系。方法(1)用Westernblotting法检测PKC亚型在耐药株KBV200及敏感株KB的表达及亚细胞分布;(2)流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度并对数据进行统计分析。结果(1)PKCα亚型的表达在KBV200中选择性升高,而PKCβ、ε无显著变化,PKCγ、ζ则未测出表达;(2)流式细胞仪检测发现KBV200细胞的PKCα的荧光强度较KB细胞显著升高,PKCβ、ε则无显著差别。结论PKC与KBV200MDR细胞株的MDR表型关系密切。在PKC亚型中,PKCα可能在KBV200细胞的MDR表型中起重要作用。     

中国仓鼠卵巢上皮细胞PKCμ亚型的克隆与表达

【目的】研究中国仓鼠卵巢上皮细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO cell)是否表达蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)μ亚型。【方法】参照GeneBank数据库PKCμ亚型的cDNA序列;通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCμ亚型的特异引物;RT-PCR扩增CHO细胞PKCμ亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCμ连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKCμ亚型。【结果】运用RT-PCR和Western blot-ting技术证实CHO细胞表达PKCμ亚型,并经测序证实。【结论】CHO细胞中发现PKCμ亚型的存在,为深入研究PKCμ亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。     

蛋白激酶C亚型与癌肿

1序言 蛋白激酶c（PKC）家族至少包括12种丝氨酸-苏氨酸激酶，其还被分为3个主要的类型：经典型（α，β和γ）、新型（δ，ε，η和θ）、非典型（μ，ξι和ι）。     

K562细胞7种珠蛋白基因mRNA水平的研究

目的：研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法：采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA，比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果：α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,β基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ，K562细胞不表达β-珠蛋白mRNA。结论：转录后水平的调控可能在K562细胞α基因簇的表达中起重要作用，β-基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。     

蛙皮素对胃癌细胞BGC-823的生长调控作用

目的:观察蛙皮素(BBS)对人低分化胃癌细胞株BGC-823的生长调控作用,测定细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量、蛋白激酶C(PKC)活性及PKC亚型的表达,探讨受体后信息传导途径。方法:BGC-823细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,于37℃、5%CO2条件下培养,分别加入不同浓度的BBS,应用MTT法观察细胞的增殖程度;应用放射免疫分析方法测定细胞内cAMP含量;应用[γ-32p]ATP掺入外源性底物的方法测定PKC活性;应用Westernblot方法分析PKC亚型α、β1、β2及ε的表达。结果:BBS能促进BGC-823细胞的生长,且与剂量呈正相关(r=0.747,P<0.05);BBS能促进细胞内cAMP的产生及PKC活性的增加,PKCα表达明显增加,而β1、β2及ε则无明显表达。结论:BBS对胃癌细胞BGC-823的生长、细胞内cAMP产生及PKC活性增加有重要作用。     

缺氧诱导滋养细胞转化生长因子3β表达及机理的实验研究

【目的】探讨低氧对滋养细胞转化生长因子-3β(TGF- 3β)的表达的诱导作用,以及缺氧诱导因子1(HIF -1)对TGF -3β表达的调控作用。【方法】滋养细胞来源的BeWo细胞系分4组培养:正常对照组、缺氧组、HIF- 1α反义组和HIF -1α正义组。HIF -1α反义组和HIF -1α正义组先加入HIF -1α寡核甘酸,常氧条件培养6h ,再低氧条件培养4 8h。4 8h后,收集细胞,实时定量PCR方法检测TGF- 3β和HIF -1αmRNA表达水平,Westernblot方法检测TGF- 3β和HIF 1α蛋白表达水平。【结果】与正常对照组相比,缺氧组的HIF -1αmRNA和蛋白表达增加,TGF- 3βmRNA和蛋白表达也升高;与HIF- 1α正义组比较,HIF- 1α反义组HIF -1αmRNA和蛋白表达降低,TGF- 3βmRNA和蛋白表达也下降。【结论】缺氧可以诱导滋养细胞TGF- 3β表达,并且缺氧对TGF- 3β表达的诱导作用可能通过HIF 1调控。     

慢性庆大霉素损伤后豚鼠前庭感觉上皮蛋白激酶C表达和活性

目的 研究庆大霉素慢性损伤后豚鼠前庭终器蛋白激酶C（PKC）活性的变化及其βⅠ，βⅡ，γ亚型的表达，探讨PKC与前庭损伤修复的关系。方法 采用免疫细胞化学法观察椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴PKCβⅠ，Ⅱ，γ亚型的表达；应用γ－^32P示踪检测前庭终器PKC活性的变化。结果 PKCβⅠ，Ⅱ，γ亚型在前庭感觉上皮细胞均呈阳性表达，上皮下结缔组织呈阴性表达，βⅡ，γ亚型较βⅠ亚型表达稍弱，不同亚型抗原分布不安全相同，与对照组相比，PKCβⅠ，γ在停止注射庆大霉素后1d其表达明显减弱，随后其表达逐渐增加，至1wk其表达已高于对照组，3wk仍未恢复，PKCβⅡ表达各组变化不明显。豚鼠前庭终器PKC活性检测结果与PKCβⅠ，γ表达变化规律基本相似。结论 庆大霉素慢性中毒后逐鼠前庭感觉上皮PKCβⅠ，γ亚型表达及PKC活性均发生变化，且不同亚型抗原分布不安全相同，提示PKC在前庭感觉上皮损伤修复过程中发挥重要作用，不同亚型可能具有不同的作用。     

蛋白激酶Cα亚型在中国仓鼠卵巢上皮细胞中的表达

目的 研究中国仓鼠卵巢上皮(CHO)细胞是否表达蛋白激酶C(PKC)α亚型.方法 参照GenBank数据库PKCα亚型的cDNA序列,通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCα亚型的特异引物,RT-PCR扩增CHO细胞PKCα亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCα连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKC α亚型.结果 RT-PCR和Western blotting方法均表明CHO细胞表达PKCα亚型,并经测序证实.结论 CHO细胞中发现PKCα亚型的存在,为深入研究PKC α亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础.     

肿胀激活状态下蛋白激酶C同工酶亚型在胃癌耐药细胞系的亚细胞分布变化

目的　探讨肿胀激活状态下,传统型蛋白激酶C(cPKC)同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR的表达、亚细胞分布变化及其意义。方法　采用免疫荧光及免疫印迹方法,观察正常状态及持续低渗灌流不同时间cPKC同工酶亚型的亚细胞分布变化。利用免疫荧光双标记及共聚焦显微镜技术观察PKCα与P-糖蛋白（Pgp）的共表达。结果　在正常状态下,cPKC的4种同工酶亚型在胃癌SGC7901及其耐药细胞SGC7901/VCR细胞质及细胞膜均有表达PKCα在耐药细胞表达呈强阳性,在药敏细胞表达呈阳性,PKCβ     

PKC亚型选择性与辐射诱导肝HepG2细胞凋亡

目的 探讨PKC在X线辐射诱导HepG2凋亡中发挥抗凋亡作用的PKC亚型选择性.进一步明确引起放射耐受的PKC亚型.方法 MTT法检测细胞存活率;HepG2细胞常规方法培养;细胞分对照组(不加任何处理因素)、辐射组(单纯6 GyX线辐射);Varian2100直线加速器,6 MV X线,剂量6 Gy,剂量率为400 cGy/min辐射细胞;流式细胞仪检测PKC亚型的荧光强度和阳性细胞百分数及细胞凋亡率.结果 辐射组HepG2细胞的PKCa平均荧光强度为2.28,与对照组细胞比较,差别具有显著统计学意义(P<0.05);辐射组细胞PKC 8平均荧光强度为5.03,与辐射前比较差别显著(P<0.01);而PKCζ、γ、ε、θ在两组细胞中平均荧光强度较低,且两组间差别不显著(P>0.05),未检测到PKC B的表达.PKCα、δ的阳性细胞百分数在对照组及辐射组较其他所测亚型为高,且辐射亦使这两种PKC亚型的阳性细胞百分数升高;其他所测亚型阳性细胞百分数较低,且辐射对它们的影响不明显.结论 PKC α、δ可能在辐射诱导凋亡的保护作用占主导地位.     

葛根素对小鼠子宫ERα、ERβ蛋白表达的影响

【目的】研究葛根素对小鼠子宫ERα、ERβ蛋白表达的影响。【方法】成年雌性小鼠腹腔注射给予葛根素500mg／ks和50mg／kg7d后，采用免疫组织化学染色结合图像分析手段检测子宫组织ERα、ERβ蛋白免疫反应阳性细胞数及其面积。【结果】与对照组相比，葛根素500mg／kg组E邴阳性细胞数和阳性细胞面积显著高于对照组（P〈0．01），ERα则无差异；葛根素50mg／kg组ERa和E邸阳性细胞数及阳性细胞面积均无差异（P〉0．05）。己烯雌酚组ERα和ERβ阳性细胞数和阳性细胞面积均显著高于对照组（P〈O．01）。【结论】500mg／kg葛根素明显增强子宫组织ERβ蛋白表达，而对ERα蛋白无明显影响，己烯雌酚则对两种ER亚型的表达均有显著上调作用，提示葛根素对子宫内膜的刺激增殖作用远低于雌激素的原因可能与其对ERβ的选择性上调有关。