bax基因siRNA序列的筛选及其对铝致神经胶质瘤细胞凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术降低促凋亡基因bax的表达,以阻抑铝诱导的神经胶质瘤细胞凋亡。方法设计了3对阻抑bax基因表达的siRNA序列,对神经胶质瘤细胞进行了转染,根据不同siRNA序列在不同转染剂量、不同转染时间的细胞活力,找到bax siRNA转染的最佳转染剂量和最适转染时间。依据RNA干扰前后bax基因的表达变化筛检出最有效的siRNA序列。用荧光染色法、荧光定量PCR法和免疫组织化学染色法分别检测其转染效率、对基因表达的干扰效率及对蛋白表达的阻抑效应。结果最有效的针对bax基因的siRNA序列为siRNA1,该序列的转染效率>90%,对bax基因表达的干扰效率为62.3%,最佳转染后检测点为转染后72h,最适转染剂量为20nmol/L。结论阻抑bax基因表达的siRNA序列能有效干扰bax基因和蛋白的表达,降低凋亡率。     

siRNA对体外培养大鼠海马神经元细胞红蛋白基因表达的抑制

【目的】 研究siRNA(small interfering RNA)对细胞红蛋白(Cytoglobin, CYGB)基因表达的抑制作用。 【方法】 取新生大鼠海马做神经元原代培养,NeuN免疫荧光抗体鉴定神经元纯度后,通过阳离子脂质体转染试剂将体外化学合成的针对CYGB基因的siRNA转入细胞中,以未转入siRNA细胞及转入阴性siRNA细胞为对照,通过转染荧光对照siRNA检测转染效率,用RT-PCR方法检测siRNA对CYGB表达的抑制作用。 【结果】 成功体外培养海马神经元,转染荧光对照siRNA结果示转染效率在70%左右,RT-PCR结果提示与阴性对照及空白对照相比,转染siRNA-78 后24 h(P＜0.01),48 h(P＜0.001)及60 h(P＜0.001)CYGB mRNA的表达明显减弱,72 h后表达无明显减少。而转染siRNA-79,siRNA-80在各时间点与对照相比没有明显差别(P＞0.05)。 【结论】 特异性针对CYGB的siRNA-78转染体外培养的大鼠海马神经元24~60 h能显著下调CYGB基因的表达。     

GRP78在蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在蛋白酶体抑制剂诱导卵巢癌细胞凋亡中的作用。方法:对3种卵巢癌细胞系SKOV3、A2870和CAOV3分别设空白对照组和不同蛋白酶体抑制剂处理组;对SKOV3细胞分别转染GRP78小干扰RNA(siRNA)和随机序列核酸siRNA组。利用蛋白酶体抑制剂MG132(5μmol/L)、PSI(20nmol/L)和EPOX(10nmol/L)作用3种细胞系,实时定量PCR和Western blot检测各组细胞GRP78 mRNA和蛋白表达。MTT和流式细胞术检测细胞活力和凋亡率。结果:各种蛋白酶体抑制剂均增加卵巢癌细胞中GRP78mRNA和蛋白表达水平。当GRP78siRNA靶向沉默GRP78表达后,蛋白酶体抑制剂作用后SKOV3细胞活力明显降低。结论:GRP78诱导表达干扰蛋白酶体抑制剂抗卵巢癌活性;沉默GRP78基因表达可提高蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞的杀伤作用。     

VEGF siRNA致中国仓鼠肺细胞染色体畸变的研究

目的研究VEGF siRNA对中国仓鼠肺细胞(CHL)的染色体畸变作用。方法采用25、50和100nmol/L的VEGF siRNA转染中国仓鼠的肺细胞,分别观察24h、48h后的染色体畸变情况。结果在VEGF siRNA转染24小时,仅100nmol/L VEGF siRNA产生可疑阳性反应,其染色体的畸变率为6%;在VEGF siRNA转染48小时后,50nmol/L的VEGF siRNA和100nmol/L的VEGF siRNA均产生可疑阳性反应,染色体的畸变率分别为6%和10%。而25nmol/L的VEGF siRNA无论是在转染后24h还是48h,均未产生染色体的畸变作用。VEGF siRNA产生的染色体畸变类型有断裂、双着丝粒、多倍体、裂隙、三射体。结论 100nmol/L的VEGF siRNA分子可引起CHL细胞产生染色体畸变。     

TRIM28磷酸化对人肺上皮细胞高致病性禽流感病毒感染过程中IFN-β和促炎细胞因子的表达

目的探究TRIM28磷酸化对人肺上皮细胞高致病性禽流感病毒感染过程中IFN-β和促炎细胞因子表达的影响。方法以人肺癌上皮细胞(human lung carcinoma cells A549,ATCC)及人肺腺癌细胞系PAa为研究对象。将细胞进行高致病性禽流感病毒ⅣAnhui/112005(H5N1)转染。将病毒转染后的细胞进行siRNA转染,对转染后的细胞的总RNA进行提取,检测各组细胞中mRNA的表达量,细胞内的蛋白表达量,细胞活性及细胞凋亡率。结果转染均siRNA2与siRNA3后能有效抑制TRIM28蛋白的磷酸化;TRIM28的磷酸化可促进IFN-β、IL-1β在细胞内的表达;与转染TRIM28 siRNA2、TRIM28 siRNA3后的对照组GAPDH和对照组scrambled siRNA中PAa细胞的G0/G1期比例(即50.02%和53.46%)相比,转染后的PAa细胞在G0/G1期的比例(60.13%和59.38%)增加(P0.05)。但转染TRIM28 siRNA2、TRIM28 siRNA3的PAa细胞的G2/M期与S期的比例均下降。结论 TRIM28磷酸化增强了人肺上皮细胞高致病性禽流感病毒感染过程中IFN-β和促炎细胞因子的表达。     

人乳腺癌hTERT RNA干扰靶序列筛选方法研究

目的:筛选针对乳腺癌有效的hTERT siRNA,为应用RNAi技术在乳腺癌中敲除hTERT基因研究提供实验基础。方法:采用化学合成法合成3段针对hTERT的siRNA、应用脂质体转染试剂分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、实时荧光定量RT-PCR技术检测hTERT mRNA表达水平以确定干扰效果。结果:3段hTERT siRNA中有2段siRNA可有效降低hTERT mR-NA表达。结论:利用化学合成法合成siRNA,应用实时荧光定量PCR技术检测目的基因干扰效果,可快速、高效筛选特异性抑制基因表达的siRNA。     

增强缝隙连接耦联对鱼藤酮染毒星形胶质细胞谷氨酸代谢的影响

目的观察增强缝隙连接耦联对鱼藤酮染毒星形胶质细胞谷氨酸代谢的影响。方法体外培养大鼠中脑星形胶质细胞,随机分为对照组、鱼藤酮组(1.0μmol/L)、缝隙链接激动剂(AAP-10)干预组(50 nmol/L)和AAP-10干预组(250 nmol/L)。MTT法观察染毒星形胶质细胞活力,应用HPLC荧光法和同位素标记法检测星形胶质细胞外谷氨酸浓度和谷氨酸转运能力的变化,RT-PCR检测星形胶质细胞谷氨酸转运体(GLAST)mRNA的表达。结果鱼藤酮染毒组星形胶质细胞活力和谷氨酸转运能力明显降低,细胞外谷氨酸浓度明显增加;AAP-10干预组(250 nmol/L)星形胶质细胞活力有所升高,细胞外谷氨酸浓度明显降低,谷氨酸转运功能活性则明显增强,且GLAST mRNA表达明显上调。结论增强缝隙连接耦联能明显改善鱼藤酮所致星形胶质细胞外谷氨酸代谢紊乱,可能与其调控GLAST基因表达和功能活性有关。     

RNA干扰对卵巢癌细胞mTOR表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人卵巢癌细胞SKOV3中mTOR的表达及对细胞增殖与凋亡的影响。方法:培养SKOV3细胞系,设计合成mTOR siRNA实验分4组:正常培养组:未转染的正常培养SKOV3细胞;空白对照组:转染空脂质体的SKOV3细胞;转染组:转染mTOR siRNA的SKOV3细胞;无义对照组:转染无义siRNA的SKOV3细胞。采用Western blot法检测各组细胞中的mTOR蛋白表达水平;应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:mTOR siRNA转染组SK-OV3细胞mTOR蛋白的表达显著低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组SKOV3细胞增殖低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组细胞凋亡率高于各对照组(P<0.05)。结论:mTOR siRNA对SKOV3细胞中mTOR蛋白的表达有明显的抑制作用,特异性阻断mTOR基因表达可显著抑制SKOV3细胞的增殖并促进其凋亡。     

靶向MICA基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

目的探讨通过小干扰RNA(siRNA)抑制MICA基因表达对胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用。方法将靶向MICA的siRNA(MICA siRNA)通过脂质体转染法瞬时转染胃癌SGC-7901细胞48 h;Western blot检测siRNA转染前后SCG-7901细胞内MICA蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MICA siRNA转染对细胞增殖的影响,TUNEL检测siRNA转染对细胞凋亡的影响。结果 MICA siRNA转染干扰SCG-7901细胞内MICA表达,并诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。细胞转染后,MICA蛋白表达降低70%~85%,明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞存活率明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论靶向MICA抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并促进细胞凋亡,MICA可用于胃癌基因治疗的靶点。     

下调VEGFR-1基因表达对抑制乳腺癌细胞增殖的影响

目的利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)下调VEGFR-1基因的表达研究对乳腺癌增殖的影响。方法设计针对人VEGFR-1基因的小干扰RNA,直接化学合成,脂质体Lipofectamine~(TM)2000作为转染试剂,转染人乳腺癌细胞系MCF-7,然后四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,半定量RT-PCR和蛋白印迹试验检测VEGFR-1 mRNA和蛋白的表达,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果实验结果显示:下调VEGFR-1基因表达,乳腺癌细胞MCF-7增殖被抑制,VEGFR-1 mRNA和其蛋白的表达明显降低,Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后MCF-7细胞凋亡明显增加。结论化学合成的siRNA能成功下调VEGFR-1基因的表达,并抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、增加凋亡;下调VEGFR-1基因的表达有可能是潜在的肿瘤治疗方法。     

bak基因干扰在铝致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的 以铝致神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为模型,研究用RNA干扰的方法阻抑bak基因的表达,找到其最优的序列、最适的转染浓度和转染时间,以减少铝引起的神经细胞凋亡.方法 将三对bak基因小干扰RNA(siRNA)序列用不同浓度铝染毒细胞,分别测定不同的siRNA序列、不同的转染浓度及不同的转染时间对细胞活力的影响.用荧光染色法计数转染效率,用荧光定量PCR法检测干扰效率,用免疫组织化学染色法测定阻抑Bak蛋白表达效果.最后,用选定的bak siRNA1作用于染铝后的神经瘤细胞,并检测其对细胞的凋亡率及坏死率的影响.结果 siRNA1序列为最有效的序列,最适转染浓度为10 nmol/L,最适作用时间为转染后24 h.siRNA的转染效率＞90%,最大干扰效率为57.76%,并表现了对Bak蛋白表达的明显的阻抑效应.bak siRNA1作用于染铝后的神经瘤细胞,可以明显降低细胞的凋亡率,但对细胞的坏死率的影响并不明显.结论 凋亡是铝致SH-SY5Y细胞死亡的重要途径,针对bak基因,用化学法合成siRNA并将其导入神经细胞,可以有效降低bak基因和Bak蛋白的表达,提高细胞活力和降低细胞的凋亡率,为预防及治疗铝诱导的神经细胞凋亡及神经退行性变的发生发展提供理论依据.     

siRNA表达载体对大鼠心肌H9c2细胞牛磺酸合成限速酶-CSD基因表达的抑制作用

目的研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的抑制作用。方法根据已克隆的大鼠心肌CSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染H9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PCR和Western-blot检测CSD mRNA和蛋白表达。结果荧光显微镜观察细胞转染效率达70%左右;与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了H9c2细胞中CSD mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而siRNA4#质粒对CSD表达无明显抑制效应(P>0.05);MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入H9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P<0.05)。结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制CSD基因的表达,且显著抑制H9c2细胞增殖,为研究CSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。[营养学报,2012,34(4):317-321]     

p,p’-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响

目的研究p,p’-DDE对离体培养支持细胞DNA损伤与FasL基因表达的影响。方法从大鼠睾丸组织中分离支持细胞进行离体原代培养3天,加入不同浓度p,p’-DDE继续培养24h,应用单细胞凝胶电泳(SCGE)和反转录聚合链式反应(RT-PCR)研究p,p’-DDE诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达。结果发现支持细胞DNA迁移度随着p,p’-DDE剂量的增高而增高,同时FasL的基因表达水平也随之增高。结论p,p’-DDE可诱导支持细胞DNA损伤和FasL基因表达,pp’-DDE可能是通过Fas/FasL途径诱导支持细胞损伤,破坏生精过程的动态平衡,最终导致精子减少。     

镉致大鼠前体精原干细胞-支持细胞共培养系损伤的形态变化

[目的]通过对大鼠前体精原干细胞．支持细胞共培养系进行镉染毒,探讨镉对前体精原干细胞和支持细胞共培养系早期效应的形态学变化。[方法]从3天龄的SD大鼠睾丸中分离前体精原干细胞和支持细胞并进行24h共培养后,再分别给予0、2．5、5．0、10．0、20．0μmol／L的氯化镉（CdCl2）染毒12h,然后用碱性磷酸酶和油红O染色分别鉴定前体精原干细胞和支持细胞,观察不同细胞的形态,并用原位末端标识法（TUNEL方法）进行细胞凋亡的原位检测。[结果]2．5μmol／LCdCl2染毒未显著改变共培养中精原干细胞和支持细胞的形态。5．0μmol／L以上浓度CdCl2染毒可致支持细胞（由油红O染色确认）的结构呈现明显变化,具有浓度依赖趋势,用TUNEL法检测发现前体精原干细胞和支持细胞均发生凋亡,和对照组相比差别有统计学意义。[结论]CdCl2染毒12h可诱导支持细胞的形态改变,以及前体精原干细胞和支持细胞的凋亡。     

特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中OY-TES-1蛋白表达的抑制作用

目的:探讨特异性siRNA对卵巢癌SKOV3细胞中肿瘤-睾丸抗原OY-TES-1蛋白表达的影响。方法:针对OY-TES-1基因设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养的卵巢癌SKOV3细胞,在转染后24、36、48、72 h,通过免疫细胞化学检测OY-TES-1蛋白的表达水平。结果:靶向OY-TES-1基因siRNA转染SKOV3细胞后,OY-TES-1蛋白的表达明显降低,其抑制作用在转染后24 h出现,转染后36 h几乎完全被抑制,转染后72 h开始出现RNAi衰减现象。结论:OY-TES-1特异性siRNA(1 486～1 504)序列可在体外有效地干扰SKOV3细胞中OY-TES-1基因的表达。     

MDR1及MDR3基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨MDR1(Multidrug resistance gene-1)及MDR3(Multidrug resistance gene-3)基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:两种质粒一起瞬时转染A2780/DDP细胞,空载体组及未转染组作为对照。Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术、MTT法、RT-PCR、western blot分别检测A2780/DDP细胞早晚期凋亡、细胞增殖活性、MDR1和MDR3 mRNA表达及caspase-3蛋白水平。结果:两种质粒(pSuppressorNeo MDR1 siRNA,MDR3 siRNA)均未能逆转A2780/DDP细胞顺铂耐药:①流式显示转染MDR1 siRNA组、MDR3 siRNA组和pSuppressorNeo空载体组后相比较未转染A2780/DDP细胞凋亡率无显著改变(P>0.05);②在一定药物浓度范围内,转染MDR1和MDR3小分子干扰RNA均未能增强顺铂对A2780/DDP细胞的细胞毒作用;③与空载体组和未转染细胞相比,A2780/DDP细胞的MDR3及MDR1 mRNA表达均低下(P>0.05);④Caspase-3蛋白表达未见增加。结论:顺铂所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1及MDR3基因过度表达均无关,卵巢癌细胞顺铂耐药为非P-gp     

SiRNA干扰靶向抑制酪氨酸蛋白激酶Lck对哮喘小鼠T细胞功能的影响

目的通过siRNA技术靶向抑制哮喘小鼠T细胞非受体酪氨酸蛋白激酶Lck的基因表达,研究Lck特异性siRNA对哮喘小鼠T细胞功能的影响。方法化学法合成小鼠T细胞Lck基因21—23bp的RNA片段,以INTERFERinTMsiRNA Transfection Reagent作为转染试剂,将合成的siRNA片段转染哮喘小鼠脾脏来源的T细胞,作用48h后再与哮喘小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）混合反应48h,收集细胞上清液,ELISA法检测细胞因子IL4、IL-13、IL-2、INF-1;Western Blot法检测T细胞Lck蛋白的含量,判断其表达是否被沉默。结果siRNA干扰组T细胞中几乎检测不到Lck蛋白的表达,且其细胞上清液中IL-4、IL-13的水平（10．19±1．66、12．34±0．79）较非siRNA干扰组（28．06±2．88、27．87±1．61）及对照组（22．07±2．51、20．47±2．37）明显下降,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论特定的21—23bp的RNA片段能够以siRNA干扰的方式有效的抑制特定基因的表达,Lck特异性siRNA可以阻断哮喘小鼠T细胞的激活和分化,减少哮喘炎症因子的释放。     

S100A6siRNA对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的探讨S100A6蛋白表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法以卵巢癌细胞A2780为研究对象,利用RNA干扰技术特异性降低S100A6表达水平后,分别用实时定量PCR和Western blot检测S100A6 siRNA对S100A6表达水平的抑制效率。用流式细胞术检测S100A6 siRNA转染前后A2780细胞的细胞周期变化,用Transwell试验观察S100A6siRNA转染前后侵袭能力的变化,用MTT法检测S100A6 siRNA对A2780细胞顺铂敏感性的影响。结果S100A6siRNA转染组细胞中S100A6 mRNA和蛋白表达水平与S100A6 siRNA呈浓度、时间依赖性明显下调,抑制效率可达63．75％～80．68％。在与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,S100A6 siRNA出现了G0／G1期比例升高,S期比例降低,差异有统计学意义（X^2=6．211,P=0．045）。Transwell试验表明,6．25、12．5nmol／LS100A6 siRNA分别转染48h后,A2780细胞芽膜细胞数目分别为78±7．51和27±8．24,与阴性对照组（91±5．78）相比,穿膜细胞显著减少,差异有统计学意义（X^2=3．898,P=0.048）。MTT法测定S100A6 siRNA转染后A2780细胞对顺铂敏感性的影响结果显示,S100A6 siRNA引起顺铂对A2780细胞的抑制率增加（X^2=9．609,P=0．022）,而空白对照组和阴性对照siRNA组之间无明显差异。对顺铂半数致死剂量（IC50）的计算结果显示,分别转染6．25、12．5nmol／LS100A6 siRNA的A2780细胞对顺铂IC50值分别为13．42μmol／L和11．32μmoL／L,与空白对照组和阴性对照siRNA组相比均显著降低,差异有统计学意义（X^2=5．566,P=0．018）。结论S100A6 siRNA转染卵巢癌A2780细胞后,引起A2780细胞GO／G1期阻滞,侵袭能力降低,同时对顺铂的敏感性有所增强,可能是卵巢癌靶向治疗的候选基因。