结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的 表达、纯化结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10(rEC)融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的应用价值.方法 用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白,用ELISA法检测血清样本中的抗结核抗体,以37例PPD阴性患者正常血清A492+2s为正常限值,评价rEC诊断的特异性及灵敏度.结果 rEC融合蛋白在大肠埃希菌中以可溶性非包涵体形式表达,表达浓度为0.19 mg/mL.rFC检测抗结核抗体在PPD阳性健康人群中的特异性为100%(30/30),在痰涂片或细菌培养阳性和两法均阴性的结核病患者中灵敏度分别为75.56%(34/45)和67.3]%(35/52).结论 结核分枝杆菌rEC融合蛋白以可溶性形式高效表达,具有较强的免疫反应性和较高的血清学诊断价值.     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

Objective To construct esat-6-cfp-10 fusion gene (ec) and its expression vector pET-23b( + )-esat-6-cfp-10 [pET-23b( + )-ec], and express rESAT-6-CFP-10 (rEC)fusion protein of Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37Rv and evaluate its immunoreactivity. Methods Fused gene encoding ESAT-6 and OP-10 of MTB was linked with the (Gly4Ser)3 linker by gene SOEing. Construction of TA cloning vector pMDR 19-T-esal-6-cfp-10 (pMDR 19-T-ec) was identified by PCR, restriction analysis and sequencing. After pMDR 19-T-ec was digested with double restriction enzymes (Nde Ⅰ and Xho Ⅰ ), the fused gene was inserted into prokaryotic expression vector pET-23b ( + ). The recombinant plasmid pET-23b( + )-ec was transformed into E. coli BL21(DE3) pLysE, and IPTG was used to induce the expreestion of rEC. Its expression was detected with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot. rEC was purified by nickel-chelate affinity chromatography. The immunoreactivity of rEC was preliminarily evaluated by Western blot. Results A recombinant plasmid pET-23b( + )-ec was successfully constructed and could stably express a 21 000 rEC, which accounted for 35% total proteins of bacillus. It existed in soluble form in E. coli. After purification, the purity of rEC reached 97.2% . Its immunoreactivity was confirmed by Western blot. Conclusions The prokaryotic expression vector pET-23b( + )-ec has been constructed and the fusion protein rEC has been obtained successfully, which provides an experimental basis for the application of rEC in the diagnosis of tuberculosis.     

结核分枝杆菌CFP10 ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10 ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10 ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10 ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10 ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25％,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为30.10％(31/103)和28.97％(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论rCFP10 ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

结核分枝杆菌H37Rv株重组抗原ESAT-6的表达纯化研究

目的表达纯化结核分枝杆菌(简称:结核杆菌)H37Rv株重组抗原ESAT-6,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b-ESAT-6转化E.coli表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导重组抗原ESAT-6表达。经SDS-PAGE电泳和Western印迹鉴定后,优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱纯化重组抗原。结果成功构建了重组质粒pET23b-ESAT-6并且重组抗原ESAT-6以可溶性形式高效表达,经亲和层析后得到高纯度有免疫原性的重组抗原(纯度>95%)。结论高纯度有免疫原性的重组抗原ESAT-6为新型亚单位疫苗的研发及其结核病血清学诊断价值研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的表达、纯化结核分枝杆菌rPstS1-HspX（rPH）融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法异丙基．陆D一硫代吡喃半乳糖苷（帆）诱导rPH融合蛋白表达,并用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。Western印迹分析纯化后融合蛋白的免疫反应性。最后用ELISA法检测194份血清抗体样本,其中来源于肺结核患者94份,非结核肺部疾病患者52份,健康对照者48份。结果rPH融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51000。经亲和层析后得到了浓度为0．62ng／mL,纯度达92％的融合蛋白。Western印迹实验证实纯化后融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫应答。重组蛋白rPH血清检测的灵敏度为77．6％（73／94）,特异性为92．0％（92／100）。结论成功表达和纯化了rPH融合蛋白,其用于结核病血清学诊断具有较好的灵敏度和较高的特异性,是ELISA的可靠抗原。     

应用酶联免疫斑点试验检测入伍新兵结核潜伏感染

目的应用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测入伍新兵结核潜伏感染情况,评价ELISPOT在检测结核潜伏感染中的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD) 皮肤试验为对照,应用ELISPOT试剂盒检测366例2009年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核菌抗原特异性γ干扰素（IFN γ）的T淋巴细胞数。对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗,10个月后再做PPD 皮肤试验和ELISPOT,比较结果。结果366例入伍新兵中,PPD皮肤试验和ELISPOT阳性率分别为44.81%和31.69%。202例PPD皮肤试验阴性和164例PPD皮肤试验阳性者中,分别有53例 （26.24%）和63例（38.41%）ELISPOT阳性,两者的一致率为57.92%（212/366）, 两者的检测结果差异具有统计学意义（χ2=14.34,P＜0.001）。在接种过卡介苗者中,PPD皮肤试验阳性率为58.53%（127/217）,ELISPOT阳性率为29.03%（63/217）,斑点形成细胞数为32.44±26.52 ;在未接种卡介苗者中,PPD皮肤试验阳性率为24.83%（37/149）,ELISPOT阳性率为35.57%（53/149）,斑点形成细胞数为41.81±30.48。110例PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗10个月后, PPD 皮肤试验阳转率为78.18%,而ELISPOT检测均为阴性。结论ELISPOT具有较高的特异性和敏感性,能真实反映入伍新兵的结核潜伏感染情况,可推广应用。     

结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85与ESAT-6在肾结核感染诊断中的应用分析

目的探讨结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85复合体(Ag85)与早期分泌性抗原靶-6(ESAT-6)在肾结核感染诊断中的意义,为临床诊断肾结核提供有效的方法。方法选取就诊经病理诊断为肾结核患者31例作为肾结核组,原发性肾小球肾炎患者30例为非肾结核组,经检查患者无结核病史、结核菌素试验以及血结核抗体均为阴性;用免疫组化的方法检测Ag85、ESAT-6在肾组织中的表达。结果肾结核组的切片发现有棕黄色、褐色阳性物质沉积,而在非肾结核组的切片中,仅在4例切片中见到浅褐色的物质沉积于肾间质;而通过检测两组切片中Ag85、ESAT-6的光密度值,发现肾结核组中的Ag85、ESAT-6的光密度值显著高于非肾结核组,差异有统计学意义;肾结核患者中Ag85的表达与ESAT-6的表达呈正相关,另外,Ag85、ESAT-6这两种抗原对肾结核分枝杆菌的敏感度均较高达100.0%,而ESAT-6对肾结核的特异度较Ag85更高,差异有统计学意义。结论 Ag85、ESAT-6在肾结核患者肾组织中的表达增强,可作为检测肾结核的补充诊断指标。     

T细胞酶联免疫斑点法对风湿病患者感染结核分支杆菌的诊断价值

目的探讨T细胞酶联免疫斑点法(T-SPOT.TB)对风湿病患者感染结核分支杆菌的诊断价值及分析风湿病患者潜伏性结核感染的状况。方法选取我院2013年4月至2014年12月收治的30例风湿病合并结核感染患者为实验组,并随机抽取未有结核感染的风湿病患者30例作为对照组。两组均采用T-SPOT.TB和结核菌素皮肤试验(TST)分别进行检测,比较两种方法的敏感度和特异度。进一步对本院收治的371例风湿病患者和371例体检健康的志愿者行T-SPOT.TB和TST检测,分析风湿病患者潜伏性结核感染的状况。结果实验组T-SPOT.TB检测阳性率为80.0%,显著高于对照组的10.0%(χ~2=29.70,P<0.01)。T-SPOT.TB诊断的敏感度和特异度分别为80.0%和90.0%,明显高于TST的46.7%和53.3%(P<0.05)。T-SPOT.TB的阳性预测值、阴性预测值、约登指数、阳性似然比均明显高于TST(均P<0.05)。另外,371例风湿病患者T-SPOT.TB检测的阳性率为18.9%,显著高于健康体检志愿者的6.2%(χ~2=27.16,P<0.01)。结论 T-SPOT.TB对风湿病患者感染结核分支杆菌具有较高的诊断价值,风湿病患者潜伏性结核感染的状况不容乐观。     

ESAT-6 and CFP-10 can be combined to reduce the cost of testing for Mycobacterium tuberculosis infection, but CFP-10 responses associate with active disease

Commercial tests measuring IFN-gamma responses to ESAT-6 and CFP-10 are available for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection. Measures that minimize cost and complexity will facilitate their application in less-developed countries. We investigated whether overlapping peptides representing both ESAT-6 and CFP-10 are required to detect M. tuberculosis infection in a high TB-burden country, and whether they can be combined in a single pool. ESAT-6 and CFP-10 peptides were compared in IFN-gamma enzyme-linked immunospot (ELISPOT) in 183 HIV-negative smear-positive TB cases and 1673 HIV-negative household contacts. Separate peptide pools for each antigen were compared with a combined pool in 498 contacts. Forty per cent of responsive contacts recognized both antigens, 51% only ESAT-6 and 10% only CFP-10, whereas 56% of responsive cases recognized both antigens, 30% only ESAT-6 and 13% only CFP-10. Accordingly, CFP-10 response rates were higher for TB cases (odds ratio 2.409, P<0.001). Low purified protein derivative response rates indicated that responses to CFP-10 only were non-specific in contacts. Agreement between peptides in separate versus combined pools was good (kappa=0.758, r=0.840). Therefore a combined ESAT-6/CFP-10 peptide pool provided maximum sensitivity and efficiency, but CFP-10 was mainly required to detect active disease.     

结核分枝杆菌特异性分泌抗原克隆和融合表达及抗原性鉴定

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP 10-ESAT-6或ESAT-6-CFP 10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP 10、ESAT～6基因。将CFP 10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后。构建CFP 10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）linker前，CFP 10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP 10融合基因，分别转化大肠杆菌XL 1—blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠肝菌BL21中表达，通过Westernblot分析其抗原性。结果二个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFPl0靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在BL21菌中高效表达。Westernblot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pETB2c（＋）-CFP 10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP 10融合蛋白，该蛋白兼具CFP 10和ESAT-6二种蛋白的抗原性。本研究为rCFP 10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断的中应用奠定了基础。     

难治性肺结核患者PBMCs结核分枝杆菌特异性Th1细胞因子反应低下

目的 研究难治性肺结核患者外周血单个核细胞(PBMCs)经结核分枝杆菌特异性抗原肽(ESAT-6,CFP-10)刺激后代表性Th1细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达特点及意义.方法 纳入67例初治肺结核患者、28例难治性肺结核患者和25位结核分枝杆菌潜伏感染者,分离外周血单个核细胞(PBMCs),用ESAT-6,CFP-10肽库刺激PBMCs,采用FlowCytomix流式技术检测细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-oα的浓度.结果 PBMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后,IFN-γ、IL-2和TNF-α均因刺激而升高,初治组的三个因子的水平均显著高于难治组和潜伏感染组(与难治组比较,Mann-Whitney U值=119.0,282.5、339.5,P均＜0.01;与潜伏感染组比较,Mann-Whitney U值=387.0,477.0、374.5,P=0.0002,0.0033、0.0001),难治组IFN-γ和IL-2的水平显著低于潜伏感染组(Mann-Whitney U值=105.5、162.5,P＜0.01),TNF-α的水平在难治组和潜伏感染组间的差异无统计学意义(Mann-Whitney U值=265.0,P=0.2695).结论 难治性肺结核患者结核分枝杆菌特异性Th1细胞因子反应低下,针对结核病的免疫治疗可能对难治性肺结核发挥更大的作用.